Princípios e Fluxo de Trabalho da Sequenciação de Amplicões 16S/18S/ITS

Sequenciação de amplificação 16S/18S/ITS utiliza a plataforma de sequenciação de próxima/terceira geração e realiza sequenciação em alta capacidade de produtos de PCR de regiões específicas, como 16S rDNA/18S rDNA/ITS/genes funcionais. Supera a desvantagem de alguns microrganismos que são difíceis ou impossíveis de cultivar, e obtém informações sobre a estrutura da comunidade microbiana, relações evolutivas e correlação microbiana com o ambiente em amostras ambientais.

O que é 16S rDNA / 18S rDNA / ITS?

rDNA 16S: O rDNA 16S é uma sequência de DNA que codifica o rRNA da subunidade pequena de procariotos, com um comprimento de cerca de 1542 bp. Com um tamanho molecular moderado e uma baixa taxa de mutação, o rDNA 16S é o marcador mais utilizado no estudo da sistemática bacteriana. A sequência do rDNA 16S consiste em 9 regiões variáveis e 10 regiões conservadas; as sequências das regiões conservadas refletem as relações genéticas entre espécies, enquanto as sequências das regiões variáveis refletem as diferenças entre espécies. O sequenciamento do rDNA 16S é utilizado principalmente para analisar a diversidade de bactérias ou arqueias.

Fig.1 Primers de amplificação e rDNA 16S

18S rDNA: 18S rDNA é uma sequência de DNA que codifica o rRNA da subunidade pequena dos ribossomas eucarióticos. Tal como o 16S rDNA, a sequência de 18S rDNA também consiste em regiões conservadas e regiões variáveis (V1-V9, ausência de V6). Entre as regiões variáveis, a V4 possui as informações de base de dados mais completas e o melhor efeito de classificação, sendo a mais utilizada e a melhor escolha para notas de análise do gene 18S rRNA. O sequenciamento de 18S rDNA reflete as diferenças de espécies entre organismos eucarióticos em amostras dadas.

Fig.2 Primers de amplificação e rDNA 18S

ITS: O ITS (Espaçador Transcrito Interno) é parte da região não transcrita do gene rRNA fúngico. As sequências de ITS utilizadas para a identificação de fungos geralmente incluem ITS1 e ITS2. Como nos fungos, os genes rRNA 5.8S, 18S e 28S são altamente conservados, enquanto o ITS pode tolerar mais mutações no processo evolutivo devido a uma menor pressão de seleção natural, apresentando um polimorfismo de sequência extremamente amplo na maioria dos eucariotos. Ao mesmo tempo, o tipo conservador de ITS é relativamente consistente dentro das espécies, e as diferenças entre espécies (ou mesmo estirpes) são óbvias. Os fragmentos de sequência de ITS são pequenos (350 bp e 400 bp de comprimento, respetivamente) e fáceis de analisar. Eles têm sido amplamente utilizados na análise filogenética de diferentes fungos.

Fig.3 Primers de ITS e amplificação

O que é a sequenciação de amplicões 16S/18S/ITS?

O princípio metodológico da sequenciação de fragmentos amplificados utiliza a tecnologia de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para amplificar seletivamente fragmentos de DNA alvo específicos. Geralmente, isto diz respeito às regiões do gene 16S rRNA de bactérias e arqueias ou às regiões do 18S rRNA/ITS para eucariotas. Estes fragmentos incorporam regiões de sequência altamente conservadas, ao mesmo tempo que abrangem zonas de variação suficiente, tornando-os instrumentos competentes para a discriminação e diferenciação de vários micróbios.

Sequenciação de amplicões 16S/18S/ITS usa Illumina ou Sequenciação PacBio ler os produtos de PCR que são amplificados com primers universais adequados de uma ou várias regiões de 16S/18S/ITSAo detetar a variação de sequência e a abundância da área-alvo, é possível obter informações sobre a classificação e abundância das espécies, estrutura populacional, evolução filogenética e comparação de comunidades de amostras ambientais. Investigar a diversidade microbiana tem implicações teóricas e práticas significativas para compreender as relações entre micróbios e o ambiente, a gestão ambiental, bem como a exploração de recursos microbianos.

Vantagens da Sequenciação de Amplicões 16S/18S/ITS

Eficiência na Identificação: Comparado com métodos tradicionais de identificação, como clonagem ou cultivo, o sequenciamento de comunidades microbianas de 16S/18S/ITS oferece uma abordagem mais rápida e precisa.

Velocidade: Contrapondo-se aos métodos tradicionais de classificação e identificação microbiana, a sequenciação de amplicons gera uma quantidade considerável de dados num período de tempo relativamente curto, acelerando assim o processamento e a análise de amostras microbianas.

Alta Sensibilidade: A sequenciação de amplicons pode detectar espécies de baixa abundância dentro de comunidades microbianas, mesmo aquelas que constituem uma proporção mínima dentro da comunidade podem ser efetivamente identificadas.

Diversidade: A sequenciação de amplicões facilita a análise simultânea de múltiplas comunidades microbianas, abrangendo uma vasta gama de microrganismos, como bactérias, arqueias e fungos, promovendo assim a sua ampla aplicabilidade.

Deteção de Região Dupla: Esta abordagem oferece flexibilidade na seleção de uma ou mais regiões variáveis, permitindo leituras de sequência mais longas e uma análise mais precisa das colónias.

Reduzir Custos: A sequenciação de amplicons requer menos profundidade quando comparada a sequenciação metagenómica, oferecendo assim uma melhor relação custo-eficácia.

Quantificável: A sequenciação de amplicons permite uma análise quantitativa dos dados de sequenciação, determinando a abundância relativa ou absoluta de micróbios, permitindo assim uma avaliação quantitativa da composição da comunidade microbiana e das suas alterações.

Fluxo de Sequenciação de Amplicões 16S/18S/ITS

Os principais passos de Sequenciação de amplicões 16S/18S/ITS incluir a extração de DNA total de amostras, amplificação por PCR de áreas-alvo, construção de bibliotecas, sequenciação e análise bioinformática.

Fig.4 O fluxo de trabalho de sequenciação de amplicões 16S/18S/ITS

Extração de DNA: Isto marca o processo de obtenção de DNA total a partir de uma amostra dada. O DNA extraído abrange segmentos provenientes de vários microrganismos, incluindo áreas do gene alvo.

Amplificação PCR em Região Alvo: Os elementos principais consistem no design de primers, amplificação por PCR, purificação dos seus produtos e a avaliação final da pureza destes produtos. O design do primer deve integrar-se de forma apertada e específica com a sequência localizada na região de interesse, frequentemente concebida numa área conservadora, para garantir a especificidade da amplificação. A amplificação por PCR envolve a preparação da mistura correspondente, a otimização das condições da reação de PCR e, em seguida, submeter a mistura à reação de amplificação por PCR.

O protocolo PCR essencial abrange uma série de ciclos, incluindo estágios de desnaturação, anelamento e elongação, permitindo que o primer se ligue ao molde de DNA e gere novas cadeias de DNA. Os subprodutos da reação PCR necessitam de purificação através de um kit de purificação PCR, removendo primers não reagidos, dNTPs e outras impurezas. Eventualmente, a eletroforese em gel é utilizada para inspecionar o tamanho e a pureza dos produtos amplificados, confirmando assim a presença apenas dos produtos de amplificação da região alvo.

Construção de Biblioteca: Recomendamos o método de construção da biblioteca de primers de fusão, ou seja, os primers fundidos com os primers da sequência alvo e os adaptadores, índices e outras sequências são sintetizados previamente, e depois os alvos de DNA genómico são amplificados diretamente por PCR. As bibliotecas de amplicons são purificadas e é preparado um pool equimolar das bibliotecas de amplicons. A diluição necessária para a preparação do template é determinada e seguida de sequenciação.

Sequenciação: As plataformas de sequenciamento atuais incluem principalmente o Illumina Miseq/HiSeq e a plataforma de sequenciamento de terceira geração.

• Illumina NGS (MiSeq/HiSeq2500/HiSeq4000): Devido à limitação do comprimento de leitura, a plataforma de NGS só pode selecionar uma única região variável, duas regiões variáveis ou três regiões variáveis como as regiões-alvo para o sequenciamento. Ao sequenciar, apenas as Leituras (Tags) completamente sequenciadas podem ser utilizadas para análises posteriores, por isso as diferentes regiões de amplificação devem seguir rigorosamente a estratégia de sequenciamento correspondente. Por exemplo, se escolher V4 para análise, é necessário o sequenciamento PE250, mas para as regiões V1-V3, a estratégia de sequenciamento deve ser PE300. Apenas desta forma se pode garantir a completude das sequências. Os dados originais são filtrados para remover leituras de baixa qualidade e deixar dados limpos de alta qualidade para análises posteriores.
• Sequenciação SMRT da PacBioAo contrário do NGS, a plataforma de sequenciação de terceira geração pode realizar sequenciação de comprimento total para 16S/18S/ITS, e a sua taxa de alinhamento de sequências e taxa de precisão na identificação são superiores às do NGS.

Análise Bioinformática: As leituras são agrupadas em Tags de acordo com a relação de sobreposição entre as leituras, e as tags são agregadas em OTUs com uma semelhança dada, sendo depois as OTUs anotadas ao comparar OTUs com bases de dados.

Unidades taxonómicas operacionais (OTUs) são frequentemente usadas para classificar grupos de indivíduos estreitamente relacionados. Em geral, se a similaridade entre diferentes sequências de 16S rDNA/18S rDNA/ITS for superior a 97%, essas sequências podem ser definidas como uma OTU. Cada OTU corresponde a um diferente sequência de 16S rDNA/18S rDNA/ITSou seja, cada OTU corresponde a uma espécie. Através da análise de OTUs, é possível conhecer a diversidade microbiana e a abundância de diferentes microrganismos na amostra.

Em seguida, com base nos resultados da anotação de OTU e espécies, são realizadas análises de complexidade das espécies das amostras e análises de diferença entre espécies. Também são fornecidas análises baseadas em espécies, análise do tamanho do efeito LDA e mais análises.

Fig.5 O fluxo de trabalho chave da sequenciação de amplicões 16S/18S/ITS

Aplicação de Sequenciação de Amplicões 16S/18S/ITS

A utilização de Sequenciação de amplicões 16S/18S/ITS abrange múltiplos setores, incluindo biologia, medicina e mais. Estas sequências, incluindo 16S rRNA, 18S rRNA e ITS, funcionam como impressões digitais moleculares de organismos como bactérias, arqueias e fungos, refletindo assim a composição e a estrutura das comunidades microbianas. O processo de sequenciação de amplicons nessas sequências permite compreender a diversidade, abundância e características de distribuição da microbiota em diferentes amostras ambientais, como solo, habitats aquáticos, flora intestinal, etc. Isso revela, consequentemente, a estrutura e as tendências evolutivas das comunidades microbianas. Além disso, Sequenciação de amplicões 16S/18S/ITS fornece uma ferramenta vital para a classificação e identificação de micróbiosAo comparar sequências de amplicões com sequências conhecidas em bases de dados, micróbios desconhecidos podem ser categorizados e o seu status taxonómico e relações filogenéticas podem ser determinados. Isto tem uma relevância significativa para a identificação de novas espécies, tipagem de espécies de micróbios ambientais e deteção de micróbios patogénicos.

Figura 6. Análise de rede da comunidade microeucariótica a nível de filo. (Xu et al., 2020)

Os microrganismos desempenham papéis fundamentais na biosfera, participando no ciclo da matéria e no fluxo de energia, melhorando a fertilidade do solo, promovendo a saúde das plantas e funcionando nos intestinos dos animais. Ao empregar Sequenciação de amplicões 16S/18S/ITSpodemos explorar os traços funcionais das comunidades microbianas, como aqueles envolvidos nos ciclos de nitrogénio e carbono, e na síntese de bioluminescência, aprofundando assim a nossa compreensão do impacto e dos papéis dos microbiomas dentro dos ecossistemas.

Na diagnóstico e tratamento de doenças, a comunidade microbiana está intrinsecamente ligada à saúde do hospedeiro. Sequenciação de amplicões 16S/18S/ITS pode, portanto, servir como uma ferramenta para o diagnóstico e terapia de doenças. Por exemplo, um desequilíbrio na microbiota intestinal está associado a condições como a doença inflamatória intestinal e doenças autoimunes. A sequenciação de amplicons da microbiota intestinal pode facilitar a compreensão dessas mudanças microbianas, fornecendo pontos de referência críticos para o diagnóstico e estratégias de tratamento de doenças. Na biotecnologia e bioengenharia, os microrganismos são amplamente utilizados em processos como produção fermentativa, remediação ambiental e biodegradação. Através da sequenciação de amplicons de microbiomas, podemos isolar estirpes com funções particulares, abrindo caminho para o desenvolvimento de tecnologias biológicas eficientes e aplicações de engenharia.

Diferenças Entre Sequenciação de 16S e Sequenciação Metagenómica:

Princípios de Sequenciação:

• A sequenciação 16S envolve a amplificação de regiões variáveis específicas (por exemplo, V3-V4 ou V4) do DNA genómico microbiano através de PCR após a extração, seguida pela construção da biblioteca e sequenciação.
• Sequenciação Metagenómica fragmenta aleatoriamente o ADN genómico microbiano em pequenos segmentos de 300-500 bp, adiciona adaptadores de sequencia a ambas as extremidades dos fragmentos e, em seguida, prossegue com a sequenciação.

Profundidade Variada de Identificação Taxonómica:

• As sequências obtidas a partir da sequenciação do 16S muitas vezes não podem ser anotadas ao nível da espécie, enquanto a sequenciação metagenómica pode identificar microrganismos até ao nível da espécie ou mesmo da estirpe.

Objetivos da Pesquisa:

• A sequenciação 16S investiga principalmente a composição das espécies, as relações evolutivas entre as espécies e a diversidade das comunidades microbianas.
• A sequenciação metagenómica, baseando-se na análise de sequenciação 16S, permite uma exploração aprofundada dos aspectos genéticos e funcionais (por exemplo, Ontologia Genética, análise de vias).

Na CD Genomics, a nossa equipa de especialistas com vasta experiência pode ajudá-lo a compreender plenamente as comunidades microbianas e a tirar partido delas. Além disso, Sequenciação de Amplicões 16S/18S/ITStambém oferecemos outros serviços de genómica microbiana, incluindo:

Sequenciação de Shotgun Metagenómica
Sequenciação Metagenómica Viral
Sequenciação Metatranscriptómica
Sequenciação do Genoma Completo Microbiano
Sequenciação do Genoma Viral

Referências:

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