O Fluxo de Trabalho e as Aplicações da Sequenciação de Amplicões

Introdução

A combinação de enriquecimento de alvos com sequenciação de próxima geração (NGS), sequenciação de amplicons é uma abordagem rápida e eficiente que permite aos investigadores explorar variações genéticas em regiões genómicas específicas. Este método utiliza sondas oligonucleotídicas específicas para direcionar e enriquecer regiões de interesse, seguido de sequenciação de alto rendimento. Esta abordagem altamente direcionada permite a sequenciação ultra profunda de amplicões (produtos de PCR), possibilitando a identificação e caracterização precisa e eficiente de mutações. Sequenciação de amplicões 16S/18S/ITS é amplamente utilizado para estudos de filogenia e taxonomia, particularmente em metagenómica amostras. Além disso, podem ser estabelecidos painéis de amplicons diversos para diagnóstico e prognóstico de doenças.

Vantagens

• Permite que os investigadores descubram, validem e analisem variantes de forma direcionada e eficiente.
• Suporta a multiplexação de milhares de amplicões por reação para alcançar uma alta cobertura de sequenciação.
• Permite sequenciação direcionada mesmo em áreas complexas, como regiões ricas em GC.
• Os designs de sondas flexíveis suportam uma ampla gama de experiências.
• Custos de sequenciação reduzidos e tempo de resposta mais curto

Fluxo de trabalho

Figura 1. O fluxo de trabalho da sequenciação de amplicões.

1. Preparação da Amostra

Extraia o DNA da amostra e quantifique o DNA.

2. Construção de Biblioteca

A abordagem de PCR em duas etapas é comumente utilizada para construir bibliotecas de sequenciamento de amplicons. Na primeira etapa, são utilizados sondas oligonucleotídicas especialmente projetadas para amplificar regiões genómicas-alvo do DNA genómico preparado e anexar um código de barras (para identificar amplicons de diferentes amostras) aos amplicons. Na etapa seguinte, são anexados adaptadores de sequenciamento. As bibliotecas devem ser validadas e purificadas para remover primers adicionais e dímeros de primers.

Figura 2. O fluxo de trabalho da PCR em duas etapas para sequenciação de amplicons.

3. Sequenciação

Os sistemas Illumina HiSeq/MiSeq e outras plataformas de NGS podem ser usados para sequenciar amplicões. O HiSeq pode gerar uma ordem de magnitude mais leituras do que o MiSeq, mas leva mais tempo.

4. Análise de Dados

A qualidade dos dados sequenciados precisa ser avaliada. Este passo determina quais leituras devem ser mantidas, filtradas, aparadas ou removidas. Dados limpos de alta qualidade são utilizados para a análise posterior.

Tabela 1. Análise de dados de sequenciação de amplicões.

Aplicações

A sequenciação de amplicons oferece flexibilidade para projetos direcionados a estudos de genética populacional, câncer e doenças genéticas, seja definida por especialistas ou designada pelo cliente. Também permite a descoberta de variantes somáticas e germinativas.

A sequenciação de amplicons foi aplicada nos seguintes campos:

Campo médicodescubra como os micróbios humanos, a saúde/doenças humanas e os genes associados a doenças estão relacionados; diagnóstico clínico e prognóstico; farmacogenómica; etc..

Campo agrícolaexplorar a interação entre microrganismos e plantas ou gado; engenharia genética; melhoramento assistido por marcadores; etc..

Campo ambientalmonitorização e avaliação ambiental; melhoria ambiental; etc..

Referência:

1. Bybee S M, Bracken-Grissom H, Haynes B D, et al. Sequenciação de amplicões direcionados (TAS): uma abordagem escalável de próxima geração para filogenética multilocus e multitaxa. Biologia do genoma e evolução, 2011, 3: 1312-1323.