Sequenciação de Sanger para Validação da Sequenciação de Nova Geração

À medida que a biologia molecular continua a avançar, as tecnologias genéticas passam por atualizações e melhorias constantes. Em 1977, a invenção do método de terminação de cadeia dideoxi por Sanger marcou um marco no campo do sequenciamento, anunciando uma nova era na análise de ácidos nucleicos e dando início à era da automação para o sequenciamento genético. Posteriormente, surgiu o aparecimento de tecnologias de sequenciamento de segunda geração, como Sequenciação de Nova Geração (NGS), melhorou ainda mais a eficiência e as capacidades das técnicas de sequenciação.

Confrontados com vastas quantidades de informação genética semelhantes às estrelas a brilhar no céu noturno, a complexidade da herança genética apresenta desafios significativos. Enquanto aproveitamos o poder da tecnologia de NGS, garantir a qualidade do sequenciamento de NGS tornou-se uma questão imperativa que exige a nossa atenção imediata.

Neste artigo, exploramos a importância da validação de NGS, o fluxo de trabalho da confirmação de NGS e as razões pelas quais a validação é imperativa na análise genómica.

O que é a Validação de NGS?

A validação de NGS é a avaliação sistemática da precisão, exatidão e fiabilidade dos ensaios e plataformas de NGS. Este processo envolve testes rigorosos para garantir a consistência e reprodutibilidade dos resultados produzidos pelas tecnologias de NGS. A validação abrange uma série de parâmetros, incluindo sensibilidade analítica, especificidade, precisão e exatidão.

Avaliação da Sensibilidade e Especificidade Analíticas

A sensibilidade analítica denota a capacidade de um ensaio de NGS para identificar variantes verdadeiramente positivas, particularmente aquelas que existem a baixas frequências alélicas. Por outro lado, a especificidade analítica refere-se à capacidade do ensaio de discernir com precisão os resultados verdadeiramente negativos, ao mesmo tempo que mitiga os falsos positivos.

Precisão e Exatidão

A precisão quantifica a extensão da reprodutibilidade ou repetibilidade dos resultados dentro de um único ensaio ou entre múltiplos ensaios. Por outro lado, a exatidão delineia o grau em que os dados de NGS produzidos se alinham com a sequência genómica autêntica.

Fluxo de Confirmação NGS

O fluxo de trabalho para confirmação em NGS prova vital na preservação da fiabilidade e precisão dos dados genómicos acumulados a partir de plataformas NGS. Este processo intricado abrange várias fases que visam verificar as variantes detectadas utilizando metodologias complementares, como Sequenciação de SangerO discurso seguinte analisa ainda os estágios individuais do fluxo de trabalho de confirmação de NGS:

Identificação de Variantes por NGS

Iniciando com a identificação de variantes por NGSEstas plataformas utilizam tecnologias de sequenciação avançadas e de alto rendimento que produzem grandes quantidades de dados de sequenciação extraídos de amostras de DNA genómico. Esta fase incipiente no fluxo de trabalho de confirmação abrange a identificação de variantes, sendo a utilização de instrumentos bioinformáticos essencial para analisar os abundantes dados brutos de sequenciação e discernir variações genéticas, incluindo SNVs, inserções, deleções e desvios estruturais.

Este processo envolve o alinhamento das interpretações de sequenciamento a um genoma de referência, distinguindo variantes e comentando sobre as suas conotações funcionais e clínicas.

Seleção de Variantes para Confirmação

Nem todas as variantes detectadas através de NGS necessitam de validação através de abordagens ortogonais. Variantes que ultrapassam os critérios de qualidade pré-definidos, incluindo profundidade de cobertura, frequência alélica variante e precisão na chamada de variantes, podem ser consideradas robustas e isentas de procedimentos de confirmação. No entanto, variantes que não atendem a esses padrões de qualidade ou que possuem relevância clínica podem necessitar de validação adicional através de ensaios de confirmação, como Sequenciação de Sanger.

Confirmação de Sequenciação Sanger

Sequenciação de Sanger, comumente referido como sequenciação por terminação de cadeia, é uma técnica clássica de sequenciação de DNA considerada o padrão para corroborar variantes genéticas identificadas através de NGSDurante a fase de validação, os segmentos-alvo que contêm as variantes identificadas são amplificados através de PCR, utilizando primers adaptados para este propósito. Subsequentemente, os fragmentos amplificados são submetidos a sequenciação Sanger, onde a incorporação de didesoxirribonucleotídeos terminadores de cadeia facilita a sequenciação de fragmentos de DNA individuais. Os dados de sequenciação resultantes são submetidos a uma análise meticulosa para decifrar a sequência de nucleotídeos, confirmando assim a existência da variante pertinente.

Análise e Interpretação de Dados

Após a conclusão de Sequenciação de Sangeros dados resultantes são comparados com os originais NGS conjunto de dados para avaliar a concordância. Quaisquer inconsistências entre estes conjuntos de dados são submetidas a uma análise minuciosa para determinar a precisão das identificações de variantes NGS. A confirmação da variante por sequenciação Sanger aumenta a confiança na fidelidade dos resultados NGS. Por outro lado, descobertas discrepantes levam a uma investigação adicional para elucidar potenciais fatores como erros de sequenciação, anomalias de alinhamento ou contaminação de amostras.

Ao aderir meticulosamente ao protocolo de confirmação de NGS, os laboratórios mantêm a integridade e a precisão dos dados genómicos provenientes das plataformas de NGS. Este regime de validação meticuloso desempenha um papel fundamental no apoio à tomada de decisões clínicas, na definição de abordagens terapêuticas personalizadas e na manutenção do mais alto padrão de cuidados ao paciente.

Por que é necessária a validação de NGS?

Apesar da adoção generalizada e do contínuo aperfeiçoamento de procedimentos padrão para NGSA validação de desempenho continua a ser um passo indispensável. Isto deve-se principalmente ao facto de que a validação de desempenho garante a precisão, fiabilidade e consistência do NGS em aplicações práticas, protegendo assim a qualidade e segurança dos diagnósticos e tratamentos clínicos.

1. Múltiplos Fatores que Afetam os Resultados de Detecção

A implementação de NGS a tecnologia não é apenas limitada por fatores como a proficiência do pessoal, as condições do laboratório, a qualidade dos instrumentos e reagentes, e a padronização dos procedimentos operacionais, mas também é suscetível a introduzir erros em cada etapa devido à sua abrangência de numerosas fases, influenciando assim significativamente os resultados finais da deteção. Especificamente, os problemas potenciais podem incluir:

• Durante o processo de construção da biblioteca, um manuseio inadequado pode levar à falha na conexão de etiquetas ou adaptadores.
• Discrepâncias ou erros nas etapas de anotação podem resultar em viés analítico.
• As técnicas de extração automatizada podem ocasionalmente induzir contaminação cruzada entre amostras, afetando a precisão dos resultados.
• A captura ineficiente de sondas pode impedir a captura eficaz de sequências-alvo.
• Erros de identificação durante o processo de etiquetagem podem resultar em má interpretação dos dados.
• Configurações de parâmetros inadequadas ou filtragem excessiva de dados durante a fase de análise de dados podem afetar a fiabilidade dos resultados.
• Erros no processo de deteção de variantes podem levar a julgamentos errados dos tipos de variantes.
• Os desvios ópticos na ótica do instrumento de sequenciação podem provocar problemas na qualidade das bases de sequenciação, influenciando ainda mais a precisão da sequenciação.

Dadas as razões acima mencionadas, diferentes processos e laboratórios apresentam frequentemente certas disparidades na qualidade de sequenciação e nos resultados da análise de informações ao implementar a tecnologia NGS. Assim, em aplicações práticas, um controlo rigoroso da qualidade operacional em cada etapa é imperativo para garantir a precisão e a fiabilidade dos dados.

2. Métodos Adicionais para Garantir a Análise de NGS e a Utilidade Clínica

A capacidade de NGS O teste para identificar variantes de relevância clínica significativa, bem como aquelas cuja relevância clínica permanece incerta, requer variações notáveis nos requisitos de validação clínica para cada variante. Além disso, a principal utilidade antecipada do teste NGS está focada em coortes de pacientes específicas, medicamentos ou domínios de doenças. No entanto, como evidenciado pelos resultados de pesquisa do programa de Análise Molecular para Escolha de Terapia (MATCH) do Instituto Nacional do Câncer, a seleção de terapêuticas ou agentes para tratamento deve ser baseada em descobertas moleculares específicas reveladas pela análise NGS direcionada, em vez de depender apenas da classificação do tipo de câncer.

O rápido avanço das técnicas de enriquecimento direcionado e NGS transformou profundamente os testes de diagnóstico clínico. Permite a análise simultânea de todos os genes envolvidos em fenótipos de doenças a um custo mais baixo, superando o sequenciamento por eletroforese capilar convencional, tornando-se assim o método preferido para a maioria dos laboratórios de diagnóstico de alto rendimento. Painéis de NGS direcionados tornaram-se o método de deteção de primeira linha para vários distúrbios genéticos. Com a adoção generalizada do NGS, numerosos laboratórios de diagnóstico introduziram painéis para genes de suscetibilidade ao câncer hereditário, capazes de detectar vários genes característicos associados ao câncer hereditário.

Existem numerosos painéis disponíveis para testar mutações genéticas conhecidas associadas ao câncer hereditário. A precisão destes testes pode ser influenciada por vários fatores, incluindo plataformas de enriquecimento direcionado, tecnologias de sequenciação, fluxos de trabalho de bioinformática utilizados e experiência na interpretação de variantes.

3. A Importância da Supervisão do NGS

Fiel ao seu compromisso em garantir a precisão e fiabilidade dos dados genómicos obtidos de NGS tecnologias, entidades respeitáveis como os Centros de Controlo e Prevenção de Doenças (CDC), o Colégio Americano de Genética Médica e Genómica (ACMG) e a Sociedade Americana de Patologia Clínica (ASCP) estabeleceram coletivamente um conjunto de diretrizes meticulosas. Estas instruções normativas dizem respeito à validação eficaz das metodologias de NGS, à supervisão diligente dos processos analíticos, bem como à elaboração abrangente de relatórios sobre as variantes identificadas. Em relação aos métodos convencionais de deteção molecular, os testes clínicos através de NGS apresentam características significativamente complexas, sublinhando assim a necessidade crítica de processos de validação robustos para os resultados derivados de NGS.

4. Desafios na Prestação de Orientação em Medicina de Precisão

Num período progressivamente marcado pela medicina de precisão e terapias personalizadas, os testes genéticos assumem um papel essencial na orientação das estratégias terapêuticas subsequentes adaptadas às necessidades de cada paciente. A pontualidade e a precisão de tais resultados diagnósticos oferecem aos clínicos evidências convincentes para informar a seleção dos pacientes mais adequados a estratégias de tratamento específicas, aumentando assim a eficácia do tratamento. Apesar das vantagens apreciáveis inerentes ao NGS - nomeadamente a sua capacidade de identificar uma vasta gama de variações dentro do genoma humano - ainda se revela deficiente na realização de validação e escrutínio individuais para cada variação proposta. Dadas as heterogeneidades nos critérios de seleção entre várias entidades patológicas, essa limitação torna-se NGS tecnologia algo inadequada na entrega de orientações terapêuticas precisas durante cenários clínicos críticos e não replicáveis que exigem urgência.

Sequenciação de Próxima Geração

A sequenciação de próxima geração, também conhecida como sequenciação de alto rendimento, evoluiu a partir de tecnologias de sequenciação de DNA baseadas em PCR e chips de genes.

A sequenciação de segunda geração introduziu a terminação reversível nas extremidades, permitindo assim a sequenciação por síntese. Na sequenciação de segunda geração, a sequência de DNA é determinada pela captura dos rótulos especiais (geralmente etiquetas moleculares fluorescentes) transportados pelas bases recém-adicionadas durante o processo de replicação do DNA. As plataformas tecnológicas existentes incluem principalmente o Roche 454 FLX e o Illumina Miseq/Hiseq.

Na sequenciação de segunda geração, as moléculas de DNA individuais devem ser amplificadas em clusters de genes compostos por DNA idêntico e, em seguida, passar por replicação síncrona para aumentar a intensidade do sinal de fluorescência para a leitura da sequência de DNA. À medida que o comprimento da leitura aumenta, a sinergia da replicação do cluster de genes diminui, levando a uma queda na qualidade da sequenciação de bases. Isso limita estritamente o comprimento da leitura da sequenciação de segunda geração (não excedendo 500 pb), conferindo-lhe assim as características de alta capacidade de processamento e comprimento de leitura curto.

Sequenciação de Sanger

o método de sequenciação por terminação de cadeia dideoxi de Sanger é o principal da sequenciação de primeira geração, frequentemente referido como Sequenciação de SangerEm quatro sistemas de reação de síntese de DNA, é adicionada uma certa proporção de ddNTP rotulado com isótopos radioativos eficazes (a tecnologia de ddNTP rotulado e a tecnologia de deteção correspondente também estão em constante melhoria e iteração). Através de eletroforese em gel e autoradiografia, a sequência de DNA da molécula em teste pode ser determinada com base na posição da banda eletroforética.

Sequenciação de Sanger é simples de operar, maduro em método, com um comprimento de leitura mais longo e uma precisão extremamente alta. É o padrão ouro para sequenciação e o padrão ouro internacional para análise de sequências genéticas. A tecnologia de sequenciação em grande escala utilizada no Projeto Genoma Humano (PGH), proposto em 1985 e formalmente lançado em 1990, é baseada no método Sanger.

A sequenciação Sanger para validação de NGS pode monitorizar eficazmente a qualidade dos dados de NGS e alcançar uma complementação e melhoria técnica.

Resultados da validação de variantes de sequenciação de próxima geração (NGS) por sequenciação Sanger. As bases verificadas estão destacadas em preto (A) variante homozigótica do gene PRNP Val129Met. (B) Variante heterozigótica no gene FGA Thr331Ala. (Zuzana Chyra Kufova et al., 2018)

Estudo de Caso de Confirmação de Sequenciação de Próxima Geração

O seguinte artigo aborda principalmente as questões de precisão e fiabilidade em relação aos resultados de deteção de câncer hereditário através de NGS tecnologia. Examina as circunstâncias sob as quais resultados variantes obtidos a partir de sequenciação NGS necessitam de confirmação adicional através de Sequenciação de Sanger.

Título: A Confirmação por Sanger é Necessária para Alcançar Sensibilidade e Especificidade Óptimas em Testes de Painéis de Sequenciação de Nova Geração

Q: Que tipos de variantes foram submetidas a sequenciação Sanger no estudo?

Neste estudo, Sequenciação de Sanger foi realizada para todas as variantes não polimórficas, totalizando 7845. Destas, 1,3% foram identificadas como NGS falsos positivos, localizados principalmente em regiões genómicas complexas, como regiões ricas em AT, regiões ricas em GC, sequências de repetição de nucleotídeos únicos e regiões de pseudogenes. A validação dos resultados experimentais foi realizada simulando um limiar de pontuação de qualidade de zero falsos positivos, o que revelou uma redução nas taxas de falsos positivos, mas também uma diminuição na sensibilidade. Portanto, para manter a maior sensibilidade e especificidade, a confirmação por sequenciação Sanger das variantes identificadas por NGS é necessária.

Q: Quando é necessária a validação do sequenciamento de Sanger durante Teste de painel NGS?

Sequenciação de Sanger a validação é justificada quando variantes não polimórficas são detetadas por NGS não cumprem os limiares de qualidade conservadores, como a cobertura mínima e a razão de heterozigose, para relato. Além disso, em regiões complexas, como regiões ricas em AT, regiões ricas em GC, sequências de repetição de nucleotídeos únicos e regiões de pseudogenes, é recomendada a confirmação por Sanger para aumentar a sensibilidade e a especificidade.

Q: Como definir limiares de qualidade apropriados para testes de Painel NGS?

Em primeiro lugar, no que diz respeito à cobertura, garantir uma cobertura mínima de 100x é essencial para garantir a precisão e a fiabilidade dos resultados de deteção. Essa cobertura satisfaz adequadamente as exigências de deteção e mitiga o risco de erros resultantes de uma cobertura insuficiente.

Em segundo lugar, relativamente à razão de heterozigose, para variantes com maior heterozigose, é aconselhável baixar moderadamente o limiar para a razão de heterozigose. Por exemplo, definir a razão de heterozigose em 40% ou mais ajuda a capturar mais informações sobre variantes, aumentando assim a sensibilidade de deteção.

Além disso, na seleção de regiões genómicas, recomenda-se empregar limiares de qualidade mais elevados para certas regiões genómicas complexas, como regiões ricas em AT, regiões ricas em GC, sequências de repetição de nucleótidos únicos e regiões de pseudogenes. Isso ajuda a melhorar a sensibilidade e especificidade da deteção, ao mesmo tempo que reduz a interferência e os erros de julgamento decorrentes de características específicas da região.

É importante notar que as definições de limiares mencionadas são baseadas em conclusões empíricas derivadas de extensos dados amostrais e não são padrões imutáveis. Em aplicações práticas, a flexibilidade na ajustação e otimização desses limiares é necessária com base nas características específicas da amostra, nas condições experimentais e nos requisitos de deteção para garantir a precisão e a fiabilidade dos resultados de deteção.

Os Resultados da Sequenciação Sanger Contradizem os Resultados da Sequenciação NGS

O processo básico de Sequenciação de Sanger inclui: primeiro, acumular uma quantidade suficiente de fragmentos de DNA da região alvo através de PCR convencional; a seguir, usar os fragmentos de DNA resultantes como modelos para amplificação com ddNTPs para produzir uma série de fragmentos de DNA de cadeia simples de comprimentos variados; finalmente, é realizada a sequenciação. É evidente que a precisão da amplificação por PCR influencia diretamente os resultados finais da sequenciação. Qualquer desvio durante a etapa inicial de amplificação por PCR pode levar a resultados de sequenciação imprecisos. Os principais fatores que afetam a precisão dos resultados da PCR são a especificidade e a precisão dos primers de amplificação, destacando a importância crucial do design dos primers.

Em geral, o design de primers deve seguir os seguintes princípios:

O comprimento dos primers é tipicamente entre 18-27 bp; primers excessivamente longos podem levar a temperaturas de extensão superiores a 74°C, inadequadas para reações com a polimerase de DNA Taq.

(2) O conteúdo de GC dos primers é tipicamente entre 40%-60%, com uma faixa ótima de 45-55%. Tanto um conteúdo de GC excessivamente alto como baixo é desfavorável para a ativação das reações. O conteúdo de GC e os valores de Tm dos primers a montante e a jusante devem ser próximos, com o valor de Tm geralmente não excedendo 5°C.

(3) A extremidade 3' do primer geralmente não contém uma base A e não deve conter mais do que três bases consecutivas, como GGG ou CCC, que podem causar falha na reação de PCR.

(4) As bases do primer são preferencialmente distribuídas aleatoriamente, e não deve haver quatro bases complementares consecutivas entre o próprio primer e entre primers.

(5) Utilize a recuperação de PCR in silico do UCSC para confirmar a especificidade dos primers.

(6) A distância entre a posição cromossómica do primer e o local de deteção deve estar entre 80bp e 800bp.

Explorando Discrepâncias entre Resultados de Sequenciação Sanger e NGS

Ao abordar casos em que Sequenciação de Sanger os resultados divergem daqueles obtidos através de NGS sequenciação, após uma validação preliminar da fiabilidade dos dados de sequenciação NGS, a nossa recomendação principal é realizar uma verificação minuciosa da especificidade dos primers utilizados na sequenciação Sanger. Através de uma análise meticulosa dos dados NGS, é imperativo examinar se os locais de ligação dos primers de amplificação Sanger contêm SNVs, uma vez que estas variantes podem interferir no processo de amplificação e resultar em disparidades entre os resultados. Se tais locais variantes forem identificados, torna-se necessário um redesenho dos primers específicos para a amostra em questão para corrigir a inconsistência entre os resultados da sequenciação Sanger e NGS.

De facto, além de raras instâncias em que mutações SNV levam a anomalias Sequenciação de Sanger resultados, o corpo humano abriga uma vasta gama de locais SNP. Estes locais SNP, abundantes no genoma, representam a forma mais prevalente de variação herdada em humanos, abrangendo mais de 90% dos polimorfismos conhecidos. Em cenários típicos, pode existir um local SNP por quinhentas a mil pares de bases, com o seu número total a ultrapassar os três milhões. Assim, a presença destes locais SNP nas sequências de primers pode igualmente induzir viés de amplificação, comprometendo a precisão dos resultados de sequenciação. Em conjunto, a questão dos viés de ligação de primers na sequenciação Sanger pode ser generalizada e merece uma atenção considerável.

Consequentemente, ao desenhar primers Sanger, deve-se fazer um esforço consciente para evitar proativamente potenciais locais de SNV e SNP. Para contornar os locais de SNP, é aconselhável consultar o site do UCSC para verificar a presença de tais locais nas sequências dos primers. Em casos de discordância entre Sanger e NGS nos resultados de sequenciação, deve ser dada atenção particular a se os primers se alinham com as regiões de SNV.

Resumo

É digno de nota que mesmo a aclamada técnica de deteção Sanger, considerada o "padrão ouro", pode, em casos extremamente raros, gerar resultados falso positivos e falso negativos. Embora tais ocorrências sejam infrequentes, exigem a nossa máxima vigilância. Assim, na prática, nenhuma técnica de deteção é isenta de falhas. Para garantir a precisão e fiabilidade da deteção de variantes, é aconselhável empregar um conjunto complementar de metodologias de deteção para abordar coletivamente os problemas e buscar a representação mais autêntica das ocorrências de variantes.

Referências:

1. Mu W, Lu HM, Chen J, et al. A confirmação por Sanger é necessária para alcançar a sensibilidade e especificidade ótimas nos testes de painel de sequenciação de nova geração. J Mol Diagn. Nov 2016;18(6):923-932. doi: 10.1016/j.jmoldx.2016.07.006. Epub 6 de Outubro de 2016. PMID: 27720647.
2. Rehm HL, Bale SJ, Bayrak-Toydemir P, et al. Padrões de laboratório clínico da ACMG para sequenciação de nova geração. Genética Médica 2013, 15:733-747.
3. C W Dieffenbach 1, T M Lowe, G S Dveksler. Conceitos gerais para o design de primers de PCR. 1993 Dez;3(3):S30-7. doi: 10.1101/gr.3.3.s30.