Sequenciação Epigenómica: Análises de Metilação de DNA entre Eucarióticos e Procarióticos

O que é a Metilação do DNA

Durante mais de uma década, as bases alteradas por metilação foram consideradas como existindo a uma baixa frequência no DNA. As metiltransferases (metilasas de DNA) que transmitem o grupo metilo quimicamente ativo do S-adenosilmetionina para o carbono 5 dos solventes de citosina ou para o grupo amino exocíclico que está ligado ao carbono 6 dos resíduos de adenina.m6A) da cadeia de ADN estão envolvidos nesta alteração do ADN.

Figura 1. Caminhos de metilação do DNA. (Moore et al., 2013)

O sequência de metilação do DNA é particular a espécies. Uma pequena proporção dos resíduos de citosina é metilada no DNA de alguns procariotos, enquanto apenas os resíduos de adenina são metilados em outros. O DNA contém tanto 5-metilcitosina (m5Cyt) como N6-metiladenina (m6Ade) no terceiro grupo de organismos procariotos. No geral, o DNA eucariótico é metilado exclusivamente por resíduos de citosina.

Metilação de DNA em Procariotos

Metilação do DNA é utilizado em bactérias como um sinal para a regulação de uma interação específica entre DNA e proteínas. Normalmente, os processos de metilação consistem em uma metilase de DNA e uma ou mais proteínas ligando-se ao DNA que podem coincidir com o local alvo de metilação no DNA, obstruindo assim a metilação desse local.

A metilação do local-alvo restringe a ligação de proteínas, o que pode levar a dois estados alternativos de metilação, metilados e não metilados, do local-alvo. Isso tende a levar a uma sequência de Metilação do DNA que governa quais genes são expressos e, portanto, como o ecossistema interage com um microrganismo.

As bactérias, arqueias e genomas de fagos apresentam níveis limitados de C5-metilcitosina, N4-metilcitosina e N6-metiladenina. A metilação do DNA ocorre após a replicação e é facilitada por metiltransferases de DNA que visam sequências específicas. As metiltransferases de DNA procarióticas dividem-se em duas categorias: aquelas integradas em sistemas de restrição-modificação e enzimas independentes que não possuem um homólogo de enzima de restrição. As funções primárias de Metilação do DNA envolvem a modulação das interacções entre proteínas ligadoras de DNA e os seus respectivos locais-alvo. Estas funções incluem a proteção contra a restrição do DNA, a facilitação da discriminação de cadeias durante a reparação de desajustes, a regulação do ciclo celular e o controlo da transcrição. Metilação do DNA também impacta as interações de patógenos bacterianos com os seus hospedeiros, sugerindo potenciais aplicações para terapias epigenéticas no combate a doenças infeciosas.

Figura 2. Visão esquemática da evolução dos padrões de metilação de DNA procariótico, com quatro mecanismos evolutivos. (Anton et al., 2021)

Metilação do DNA em Eucariontes

Metilação do DNA em eucariotos é frequentemente utilizado para desligar a função de sinalização dos genes. Em muitos mecanismos eucariotos, como o crescimento embrionário, a impressão do genoma, a inativação do cromossoma X e, geralmente, a manutenção da consistência dos cromossomas, Metilação do DNA tem demonstrado ter uma função vital. Em mamíferos, onde a fase de metilação para 75% de todos os dinucleotídeos CpG ocorre em células somáticas, o processo é muito preciso.

Considerando a magnitude da influência de Metilação do DNANão é estranho que várias doenças, como as observadas em humanos, também estejam ligadas a estes efeitos. A tendência global de metilação em mamíferos torna difícil avaliar se a metilação é uma situação padrão ou se é direcionada a sequências genéticas particulares. As ilhas CpG, no entanto, ocorrem tipicamente perto dos locais de início da transcrição, implicando que existe uma estrutura de identificação.

Figura 3. Relação evolutiva das metiltransferases de DNA eucarióticas. (Schmitz et al., 2019)

Diferença entre a Metilação do DNA em Procariotos e Eucariotos

Metilação do DNA ocorre em eucariotos apenas nos resíduos de citosina e especialmente para sequências CpG. Enquanto nos procariotos, o principal sinal epigenético é a metilação dos resíduos de adenina. Apenas algumas metiltransferases de DNA são utilizadas pelos eucariotos; nas bactérias, onde muitas delas têm alta precisão de sequência, os números são muito maiores. O significativo patógeno gástrico humano Helicobacter pylori, por exemplo, possui um grande repertório de genes de metiltransferase de DNA, com várias estirpes envolvendo sequências distintas e bastante especiais.

Mesmo assim, tanto em procariotos como em eucariotos, o mecanismo de defesa de Metilação do DNA é comparável. Em humanos e roedores, por exemplo, sequências virais incorporadas podem ser metiladas para suprimir os genes implementados. Em ratos, também, os mesmos processos foram descobertos para suprimir transgenes. As características de reconhecimento e erradicação de Metilação do DNA as máquinas, portanto, parecem estar preservadas.

Como o genoma eucariótico é muito mais intricado em comparação com o genoma procarioto, o impacto da citosina metilada como uma "quinta base" no genoma eucariótico tem sido sugerido por muitas pesquisas. Além disso, muitos estudos mostraram que a metilação da citosina está implicada na reorganização funcional do genoma eucariótico.

Tabela 1 Diferença entre a metilação de DNA em procariotos e eucariotos

Métodos de Sequenciação de Metilação de DNA

A análise do metiloma de DNA foi realizada utilizando microarranjos durante muitos anos. A sequenciação da metilação do DNA é uma inovação recentemente desenvolvida, baseada principalmente na conversão com bisulfito para distinguir entre citosinas metiladas e citosinas não metiladas. As citosinas não metiladas são transformadas em uracilos após o diagnóstico com bisulfito, enquanto as 5mCs são não reativas e mantidas. As citosinas não metiladas são lidas como timina na fase de sequenciação, enquanto as citosinas metiladas continuam a ser lidas como citosina.

Figura 4. A evolução da metodologia de perfilagem de metilação de DNA. (Li et al., 2021)

A sequenciação baseada na conversão de bisulfito pode ser realizada como ou. Sequenciação de Bisulfito de Genoma Completo (WGBS) ou Sequenciação de Bisulfito com Representação Reduzida, com base na cobertura genómica (RRBS). WGBS cobra mais e há um envolvimento muito maior na avaliação de dados afiliados. Em vez disso, o RRBS oferece um método rentável para a análise da metilação do DNA, amostrando áreas do genoma ricas em CpG. O DNA genómico é processado com uma enzima de restrição insensível à metilação, como a MspI, para realizar RRBSPara criar uma biblioteca para sequenciação, os fragmentos de DNA digeridos são então submetidos a ligação de adaptadores, conversão com bisulfito e PCR.

Figura 5. Visão geral do WGBS e RRBS. (Li et al., 2021)

WGBS e RRBS são duas técnicas de sequenciação que dependem do tratamento com bisulfito. Além disso, as metodologias que aproveitam esta abordagem incluem sequenciação de metilação/hidroximetilação de DNA direcionada (oxBS-seq). Em oxBS-seqa conversão de 5-hidroximetilcitosina (5hmC) em 5-formilcitosina (5fC) e, subsequentemente, em uracilo (U) após o processamento com bisulfito, permite a identificação precisa de 5-metilcitosina (5mC). OxBS-seq apresenta um fluxo de trabalho experimental simplificado em comparação com o BS-seq, permitindo a quantificação específica de 5mC e 5hmC em cada sítio de citosina modificado na amostra de DNA.

A segunda categoria compreende métodos de sequenciação baseados na captura de anticorpos específicos, incluindo principalmente sequenciação por imunoprecipitação de DNA metilado (meDIP-seq), sequenciação por imunoprecipitação de DNA hidroximetilado (hmeDIP-seq), e Sequenciação por imunoprecipitação de 6mA (6mA-IP-seq). meDIP-seq é uma técnica de deteção de metilação do genoma completo baseada no princípio de enriquecimento por anticorpos. Utiliza a imunoprecipitação de DNA metilado para enriquecer seletivamente fragmentos de DNA metilados no genoma utilizando anticorpos 5mC. Subsequentemente, o sequenciamento de alto rendimento permite estudos de alta precisão, densos em CpG e em regiões altamente metiladas a nível do genoma completo. 6mA-IP-seq utiliza anticorpos projetados para a modificação de DNA 6mA para enriquecer seletivamente regiões genómicas que contêm a modificação 6mA. Quando acoplado a sequenciação de alto rendimentoesta abordagem permite um mapeamento preciso das modificações de 6mA no genoma. 6mA-IP-seq apresenta vantagens significativas, incluindo alta precisão, ampla gama de deteção, especificidade de direcionamento excecional e aplicabilidade versátil.

Figura 6. Princípio chave do MeDIP-seq. (Li et al., 2021)

Além disso, os estudos de perfilagem de metilação de DNA em células únicas e amostras minúsculas estão significativamente limitados pelas tecnologias de sequenciação de construção de bibliotecas. Os métodos tradicionais de construção de bibliotecas ou técnicas de amplificação de células únicas que se assemelham ao DNA genómico são difíceis de aplicar em experiências de metilação. A sequenciação de bisulfito de genoma inteiro em células únicas (scWGBS) aborda esta limitação. A scWGBS é uma abordagem altamente inovadora que combina a preparação de bibliotecas de WGBS em células únicas com a Illumina. sequenciação de nova geração tecnologia. Este método permite a visualização do estado de metilação do genoma com resolução a nível de célula única, revelando a heterogeneidade celular tipicamente mascarada pela sequenciação de metilação em massa padrão. Estudos de metilação de células únicas e amostras raras são aplicados principalmente em mecanismos tumorais, investigação do câncer, diagnóstico pré-implantação, desenvolvimento embrionário inicial, recombinação de células germinativas, células estaminais e áreas de investigação sobre heterogeneidade celular.

Referências:

1. Moore, L., Le, T. & Fan, G. Metilação do DNA e a Sua Função Básica. Neuropsicofarmacologia2013, 38, 23–38.
2. Li S, Tollefsbol T O. Métodos de metilação de DNA: Análises globais de metilação de DNA e metilómica. Métodos, 2021, 187: 28-43.
3. Casadesús J, Sánchez-Romero M A. Metilação de DNA em procariotas[M]//Metiltransferases de DNA - Papel e Função. Cham: Springer International Publishing, 2022: 21-43.
4. Anton B P, Roberts R J. Além da modificação de restrição: papéis epigenómicos da metilação do DNA em procariotos. Revisão Anual de Microbiologia, 2021, 75: 129-149.
5. Schmitz R J, Lewis Z A, Goll M G. Metilação de DNA: características partilhadas e divergentes entre eucariotos. Tendências em Genética, 2019, 35(11): 818-827.