Sequenciação de rRNA 16S de Comprimento Total Melhora a Análise Microbiana a Nível de Espécies

À medida que a pesquisa microbiológica avança, a importância da identificação a nível de espécie em comunidades microbianas torna-se cada vez mais evidente. A identificação precisa de microrganismos-chave a nível de espécie é crucial para a validação experimental subsequente e a descoberta mecanística. Tradicional tecnologias de sequenciação de segunda geração (SGS), limitados por comprimentos de leitura curtos, normalmente capturam apenas 1-2 regiões variáveis do gene 16S rRNA (e.g., a região V3-V4). Esta limitação prejudica a capacidade de identificar plenamente e com precisão as espécies dentro das comunidades microbianas, tornando as análises a nível de espécie incompletas. Em contraste, tecnologia de sequenciação de rRNA 16S de comprimento total captura todas as nove regiões variáveis (V1-V9) numa única leitura, melhorando drasticamente a precisão da anotação a nível de espécies. Consequentemente, esta tecnologia oferece vantagens substanciais para a pesquisa de comunidades microbianas, particularmente em áreas como microbiomas do intestino, respiratório, reprodutivo, ambiental, de gado e de aquicultura, onde tem sido amplamente aplicada.

Demonstração de Sequenciação da Diversidade Completa do rRNA 16S

A figura abaixo compara a reconstrução de uma comunidade microbiana simulada utilizando tanto SGS como sequenciação de diversidade de comprimento totalA nível de espécies, os resultados do SGS apresentam vários táxons não anotados e uma falta de coerência, enquanto os resultados de sequenciação de comprimento total reconstituem com precisão todas as espécies presentes na comunidade de controlo, com anotações consistentes e precisas.

Figura 1. Reconstrução da comunidade simulada utilizando diversidade de segunda geração e diversidade de comprimento completo, respetivamente.

A tabela abaixo apresenta as taxas de anotação de espécies para amostras comuns usando sequenciação completa do rRNA 16SNotavelmente, as taxas de anotação a nível de espécie para sequências completas são altamente satisfatórias. Para amostras de fezes e conteúdo intestinal, a taxa de anotação a nível de espécie atinge 90%, enquanto para amostras ambientais mais complexas, como solo e água, a taxa ainda atinge 75%. Isso indica que a grande maioria das unidades taxonómicas operacionais (OTUs) ou sequências pode ser anotada com precisão a espécies específicas, proporcionando um valor significativo na identificação rápida de microrganismos-chave em amostras.

As taxas de anotação a nível de espécie e género, com base em dados de OTU e de leitura, demonstram claramente o desempenho superior do sequenciamento de diversidade de 16S rRNA de comprimento completo na investigação de comunidades microbianas. Esta vantagem é particularmente evidente em estudos clínicos, agrícolas e ambientais, onde a caracterização microbiana abrangente e precisa é essencial.

Vantagens da Sequenciação Completa do rRNA 16S

Os resultados práticos descritos acima sublinham a vantagem substancial do sequenciamento da diversidade do rRNA 16S completo na identificação de organismos a nível de espécie. Do ponto de vista técnico, vários fatores contribuem para este desempenho aprimorado.

Vantagens Técnicas do Sequenciamento Completo do rRNA 16S

• A diversidade completa do rRNA 16S Os primers utilizados na nossa metodologia abrangem todas as nove regiões variáveis do gene 16S rRNA, mitigando assim o viés comumente associado à seleção de primers.
• A sequenciação é realizada utilizando a plataforma PacBio Single Molecule, Real-Time (SMRT) no modo de Sequenciação de Consenso Circular (CCS), garantindo uma precisão de sequência superior a 99%. Esta abordagem reduz significativamente o risco de má classificação a nível de género e espécie, ao mesmo tempo que melhora a precisão da identificação taxonómica a nível de espécie.

Figura 2. Estrutura do 16s

As tecnologias de sequenciação de segunda geração normalmente geram comprimentos de leitura mais curtos, cobrindo apenas uma a duas regiões variáveis do gene 16S rRNA. Em contraste, a plataforma PacBio de terceira geração produz sequências de leitura longa com um comprimento médio que varia de 8 a 15 quilobases (kb), permitindo uma cobertura abrangente de todas as nove regiões variáveis.

Figura 3. Diagrama do Fluxo de Trabalho de Sequenciação (Esquerda) e Demonstração da Precisão de Sequenciação do Site PacBio (Direita)

Vantagens dos Resultados:

1. Identificação precisa de espécies

2. Reconstrução precisa da composição da comunidade microbiana

Em 2019, Johnson et al. realizaram uma reavaliação abrangente do potencial taxonómico do gene 16S rRNA a níveis de espécie e estirpe, utilizando tanto análise bioinformática como experiências de sequenciação. Os seus resultados indicaram que direcionar plataformas de sequenciação de leituras curtas para regiões variáveis do gene 16S não fornece a resolução taxonómica alcançada pela sequenciação do gene completo (~1500 bp).

Esta conclusão destaca uma limitação significativa nas metodologias de sequenciação de leituras curtas, onde apenas regiões parciais do gene são capturadas. Em contraste, sequenciamento completo de 16S—como o possibilitado pela sequenciação contínua de longas leituras da PacBio—permite uma resolução muito mais elevada na diferenciação a nível de espécies e estirpes, garantindo a precisão do perfilamento de comunidades microbianas.

Os autores observaram que certas regiões hipervariáveis do gene 16S rRNA eram capazes de diferenciar espécies microbianas em graus variados (Figura B). No entanto, o sequenciamento completo do 16S rRNA demonstrou a capacidade de resolver com precisão todas as sequências ao nível das espécies. Uma comparação de diferentes regiões variáveis revelou preconceitos na classificação taxonómica bacteriana (Figura C).

A seleção de regiões variáveis influenciou significativamente o número de OTUs gerados durante a agrupamento. Ao agrupar sequências com 99% de similaridade, várias regiões variáveis não conseguiram reproduzir o número real de táxons presentes na comunidade microbiana (Figura D).

Estas descobertas enfatizam as limitações das abordagens de sequenciamento parcial de 16S, particularmente em ambientes onde uma alta resolução taxonómica é necessária. O sequenciamento de 16S de comprimento completo, ao cobrir todas as nove regiões hipervariáveis, fornece uma representação mais abrangente e precisa da diversidade microbiana.

Caso de Aplicação de Sequenciação da Diversidade do rRNA 16S de Comprimento Completo

Título: Comunidades Bacterianas de Cassiopea nos Keys da Flórida Partilham Principais Taxas Bacterianas com Microbiomas de Coral

Publicado em: bioRxiv

Tecnologia: Análise da Diversidade do rRNA 16S em Comprimento Total

Em 2023, a nossa equipa de investigação publicou um preprint no bioRxiv utilizando a tecnologia PacBio Sequel para investigar as comunidades bacterianas associadas às medusas Cassiopea nos Keys da Flórida. O estudo teve como objetivo descobrir a dinâmica destas comunidades microbianas e as suas relações com as bactérias associadas aos corais.

Através de sequenciação completa do 16S rRNA, identificámos táxons bacterianos significativos prevalentes tanto em Cassiopea como em microbiomas de corais nas proximidades, como Endozoicomonadaceae e Vibrionaceae. As nossas descobertas revelaram composições microbianas distintas entre as comunidades internas (cavidade gastrovascular) e externas (muco) das medusas, com a comunidade interna a apresentar uma diversidade inferior em comparação com as amostras externas e ambientais.

Também observámos variações espaciais na composição da comunidade em diferentes locais, indicando que, embora a Cassiopea não possua um microbioma central estrito, certos táxons se associam consistentemente a estas medusas. Isto destaca a importância ecológica destas famílias bacterianas e o seu potencial papel na saúde da Cassiopea.

Gráficos de barras de nível de pedidos agrupados por localização

Gráfico de mosaico da identidade de partição de Dirichlet (tipo de comunidade) por local

Este estudo melhora a nossa compreensão dos microbiomas de cnidários e da sua importância ecológica, fornecendo dados fundamentais para futuras investigações sobre a dinâmica microbiana em ecossistemas marinhos. As implicações estendem-se a discussões sobre relações simbióticas e a saúde dos ecossistemas, particularmente no contexto de condições ambientais em mudança.

Título: Metabolito Microbiano Aumenta a Eficácia da Imunoterapia ao Modular a Stemness das Células T em Pan-Câncer

Diário: Célula

Tecnologias Ómicas: Diversidade completa do rRNA 16S, MetagenómicaMetabolómica não direcionada, Genoma bacteriano único, Transcriptómica de célula única

Em março de 2024, a Cell publicou um estudo inovador que revelou um novo mecanismo anticancerígeno mediado pela microbiota intestinal. Este estudo demonstrou inicialmente, através de experiências de transplante de microbiota fecal (TMF) em ratos, que o microbioma intestinal tem uma influência direta na resposta à terapia de bloqueio de pontos de verificação imunológicos (BPVI).

Usando sequenciação completa do rRNA 16S, os investigadores compararam os microbiomas fecais de ratos que exibiam respostas fracas e fortes à terapia ICB. A análise ao nível do género revelou uma diminuição na abundância de espécies de Lactobacillus no grupo de resposta fraca. Ao nível da espécie, Lactobacillus johnsonii apresentou a diferença de abundância mais significativa entre os dois grupos (conforme mostrado na figura acompanhada).

Após identificar L. johnsonii como uma espécie chave, os investigadores aprofundaram-se no seu papel funcional. Experimentos em animais demonstraram que a administração oral de L. johnsonii aumentou a eficácia da terapia anti-PD-1 e aumentou a proporção de infiltração de células T CD8+ nos tumores. Em estudos subsequentes, utilizando metabolómica, genómica bacteriana e transcriptómica de célula única, os autores exploraram como L. johnsonii e outros micróbios intestinais críticos modulam a resposta imunitária à terapia contra o câncer.

Os resultados confirmaram que L. johnsonii aumenta a eficácia da ICB ao promover a síntese de ácido indole-3-propiónico (IPA) e aumentar a atividade de células T progenitor-exauridas (Tpex). Estas descobertas oferecem novas perspetivas sobre como a microbiota intestinal pode ser aproveitada para melhorar os resultados da imunoterapia do cancro.

A CD Genomics oferece um conjunto completo de serviços ómicos, agora com padrões de entrega de ponto único melhorados. O nosso portfólio de produtos abrangente inclui análise da diversidade microbiana, metagenómica, metatranscriptómica, genómica microbiana, reessequenciação de plantas e animais, transcriptómica, transcriptómica procariótica, sequenciação de pequenos RNAs, análise de lncRNA, sequenciação do transcriptoma completo, e transcriptómica espacial, entre outros.

Referências:

1. Jia D, Wang Q, Qi Y, Jiang Y, He J, Lin Y, Sun Y, Xu J, Chen W, Fan L, Yan R, Zhang W, Ren G, Xu C, Ge Q, Wang L, Liu W, Xu F, Wu P, Wang Y, Chen S, Wang L. Metabolito microbiano melhora a eficácia da imunoterapia ao modular a "stemness" das células T em pan-câncer. Célula. 2024
2. Kaden Muffett, Jessica Labonte, Maria Pia Miglietta. As comunidades bacterianas de Cassiopea nos Florida Keys partilham principais táxons bacterianos com os microbiomas de corais. Biorxiv 2023