Métodos de deteção para Análise de Mutacões Genéticas

Como um ponto focal na investigação atual em ciências da vida, a mutação genética beneficia de metodologias de deteção em rápida evolução, sinónimas do campo. Os avanços nas técnicas de deteção de mutações genéticas têm um significado significativo para o diagnóstico e tratamento precoce de doenças. O objetivo deste artigo é fornecer uma exposição concisa de várias metodologias de deteção de mutações genéticas comumente utilizadas e os seus princípios subjacentes. Isto destina-se a ajudar na seleção apropriada com base nos objetivos dos testes e nas condições experimentais.

Southern blot

Concebida pelo eminente biólogo britânico Edwin Southern em 1975, a hibridização por Southern blot é uma técnica pioneira desenvolvida para a deteção específica de DNA. Ancorada no princípio fundamental da complementaridade de bases, este método explora a hibridização precisa e seletiva de duas cadeias simples de ácidos nucleicos que exibem homologia sob certas condições, levando à formação de uma estrutura de dupla hélice. Sendo a primeira manifestação das metodologias de blotting, a hibridização por Southern blot mantém uma presença vital no campo da biologia molecular.

No seu cerne, o mecanismo da hibridação de Southern blot baseia-se no princípio do emparelhamento complementar de bases. Este processo envolve cadeias de ácidos nucleicos que, possuindo um certo grau de homologia, participam seletivamente na formação de estruturas de dupla hélice sob condições predeterminadas. Desde que o material-alvo incorpore sequências complementares à sonda, a sua interação é possibilitada através do emparelhamento preciso de bases. Após a remoção de sondas não ligadas através de processos de lavagem, a identificação e quantificação dos fragmentos hibridizados são realizadas utilizando modalidades como autoradiografia (Figura 1) ou outras metodologias adequadas.

À luz da sua superior sensibilidade e especificidade, a hibridização por Southern blot ganhou rapidamente reconhecimento como o método de deteção molecular arquetípico no espectro das técnicas de hibridização de sondas. A sua utilidade abrange uma infinidade de áreas, como a delimitação de mutações genéticas e a análise do Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP).

Figura 1. Análise de Southern blot (Rajiv Kumar et al., 2012).

PCR

No domínio da deteção de mutações genéticas, a tecnologia do Southern blot tem ocupado uma posição proeminente desde 1985, sendo capaz de discernir várias formas de mutação, como deleções de genes, inserções e recombinações de deslocamento de quadro. No entanto, sob as limitações tecnológicas da época, a incapacidade de amplificar artificialmente genes-alvo dentro das amostras tornava certas mutações indetetáveis pelo Southern blot. Consequentemente, as mutações que escapavam à análise do Southern blot exigiam uma complexa mutagénese de DNA mediada por oligonucleótidos in vitro, seguida de uma laboriosa análise de sequências de DNA para confirmação—um método caracterizado pela sua complexidade, natureza demorada e custos elevados.

A introdução da tecnologia de Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) assinalou uma mudança de paradigma nos diagnósticos moleculares, particularmente no que diz respeito à deteção de mutações genéticas. Essencialmente, todos os métodos modernos de diagnóstico molecular giraram em torno da metodologia PCR. A implementação da tecnologia PCR provocou avanços substanciais em múltiplas dimensões de deteção: automatizou procedimentos, reduziu o tempo de análise e aumentou significativamente a precisão dos resultados. De facto, a integração da tecnologia PCR constituiu um desenvolvimento seminal na investigação da deteção de mutações genéticas.

1. ARMS-PCR

O Sistema de Mutação Refratária à Amplificação - Reação em Cadeia da Polimerase (ARMS-PCR), também conhecido como PCR Específica de Alelos (AS-PCR), baseia-se no princípio da reação de extensão específica de alelos. Esta técnica só avança quando os pares de primers de um alelo específico se alinham com o local da mutação, permitindo que a reação de extensão ocorra. Globalmente, o ARMS-PCR emergiu como uma das tecnologias mais críticas e avançadas no âmbito da deteção molecular individual de tumores. Simultaneamente, é um dos instrumentos tecnológicos mais precisos no campo da deteção de doenças genéticas.

A distinção entre ARMS-PCR e a PCR convencional reside no design do primer para genes específicos de alelos. Dois primers a montante têm sequências de extremidade 3' diferentes. Durante o processo de amplificação por PCR, primers a montante que não conseguem corresponder completamente ao molde falham em formar pares de bases completamente complementares, levando a um desalinhamento. Uma vez que este desalinhamento atinge um certo nível, a extensão do primer é terminada, e nenhum produto de amplificação por PCR de comprimento específico pode ser obtido, indicando que o DNA molde não possui um par de bases com a extremidade 3' do primer, e vice-versa (Peng et al., 2018). Neste momento, os cientistas estenderam a metodologia ARMS-PCR para incorporar quatro primers (Tetra-Primer ARMS-PCR), onde quatro primers de PCR são desenhados simultaneamente, dois dos quais estão localizados no local SNP da extremidade 3' e têm direções opostas pertencentes a diferentes genótipos, enquanto os outros dois estão localizados fora do SNP (Figura 2).

Figura 2 ARMS-PCR (Ye et al., 2001)

2. PCR Digital

A PCR digital (dPCR) epitomiza uma técnica avançada para a quantificação absoluta de ácidos nucleicos. Considerada a terceira geração das tecnologias de PCR, é vista como seminal na área das ciências da vida e diagnósticos clínicos. Este conceito foi trazido à luz pela primeira vez em 1999 pelos luminares Bert Vogelstein e Kenneth W. Kinzler.

A PCR digital é um sistema único que microparticiona as amostras em gotículas, garantindo uma média de uma ou zero moléculas de DNA alvo em cada partição. Após a amplificação por PCR, a presença ou ausência de fluorescência em partições discretas é registada utilizando um sistema binário. Neste sistema, a presença de fluorescência é denotada como 1 e a não fluorescência como 0. A análise estatística subsequente dos sinais de fluorescência permite uma quantificação absoluta precisa de espécies selvagens e mutantes dentro da amostra em teste. Este elevado nível de sensibilidade permite a deteção de mutações tão baixas quanto uma única cópia. (Figura 3)

Figura 3. Fluxo de trabalho dPCR (Cao et al., 2020)

3. GRH

A análise de Curva de Derretimento de Alta Resolução (HRM), inventada pelo Professor Carl Wittwer da Patologia Molecular da Universidade de Utah, é um avanço tecnológico baseado na reação em cadeia da polimerase (PCR); é especialmente projetada para a detecção de mutações genéticas e genotipagem. A HRM baseia-se principalmente num sistema que combina de forma fiel fragmentos-alvo de PCR adequadamente projetados para o propósito de uso, um corante fluorescente de DNA de dupla hélice saturante, um sistema de instrumentos capaz de obter sinais de curva de derretimento de alta resolução regulados termicamente, e um sistema de análise de software de curva de derretimento. Devido à sua simplicidade, custo-efetividade, rapidez, modo pós-PCR em tubo fechado que mitiga o risco de contaminação secundária, e alta sensibilidade de deteção, a técnica tornou-se rapidamente amplamente adotada para várias análises genéticas em campos médicos e outras áreas relacionadas à biologia.

O princípio principal da Gestão de Recursos Humanos explora a propriedade de um tipo de corante de DNA de cadeia dupla (dsDNA) saturante capaz de se integrar no produto da PCR. Envolve o monitoramento em tempo real do desenrolar do dsDNA durante o processo de aquecimento, as subsequentes desligações do corante fluorescente levando a uma redução ou total desaparecimento dos sinais fluorescentes, e o registo preciso da curva de fusão em alta resolução. Assim, permitindo uma análise altamente sensível das mutações da amostra. polimorfismos de nucleótido único (SNPs)e locais de metilação na resolução de uma única base.

Figura 4 Princípio de GRH (Nguyen-Dumont et al., 2011)

As limitações da tecnologia HRM, semelhantes a outros métodos de deteção de mutações genéticas, incluem dificuldades na identificação de locais de mutação desconhecidos e a sua sensibilidade sendo influenciada pelo tipo de Variantes de Nucleotídeo Único (SNVs) no segmento genético em análise. No entanto, tal como outros métodos de teste genético que visam fragmentos específicos de genes, a tecnologia HRM oferece várias vantagens, incluindo flexibilidade, rapidez, alta sensibilidade e custo-efetividade. Além disso, tem a capacidade de detetar todos os tipos de mutações genéticas. Também oferece a adaptabilidade para aumentar a capacidade de testes, o que conserva a quantidade de amostra utilizada, reduz o tempo e o custo dos testes e minimiza o risco de contaminação — uma solução óptima para satisfazer as exigências dos testes clínicos.

4. IAT

A Tecnologia de Amplificação Isotérmica (IAT) é outro método que evoluiu a partir da PCR tradicional. Funciona a uma temperatura constante para amplificar o DNA, tornando-se extremamente rápida, sensível, simples, portátil e altamente específica. A IAT possui um potencial de aplicação excecional dentro do diagnóstico molecular, particularmente em testes à beira do leito e triagens no local. O princípio fundamental da IAT reside na utilização de várias enzimas, como polimerases de deslocamento de cadeia, spliceossomas de RNA, entre outros, para completar a amplificação de DNA em condições isotérmicas com base num esquema de amplificação de DNA circular. Durante a IAT, um design apropriado de primers pode gerar diferentes comprimentos de fragmentos de RNA através da função de um spliceossoma de RNA. A deteção destes fragmentos de RNA facilita a análise de mutações específicas dentro da sequência de DNA.

Figura 5 PCR e alguns sistemas IAT (Boonbanjong et al., 2022)

Com o contínuo avanço das metodologias biotecnológicas, a IAT deu origem a uma diversidade de técnicas. Estas incluem Amplificação Isotérmica Mediadas por Loop (LAMP), Amplificação por Círculo Rolante (RCA), Amplificação Baseada em Sequência de Ácido Nucleico (NASBA), Amplificação de DNA Isotérmica Dependente de Helicase (HDA), Amplificação por Polimerase Recombinante (RPA), Reação de Amplificação por Enzima de Corte (NEAR), Amplificação por Deslocamento de Cadeia (SDA) e Reação de Cadeia de Hibridação (HCR).

Sequenciação de genes

A essência da sequenciação de genes envolve a utilização de um sequenciador de genes para determinar a disposição das quatro bases nucleotídicas (adenina [A], timina [T], guanina [G] e citosina [C]) num gene. O princípio subjacente envolve rotular os quatro tipos de bases no gene com cores de fluorescência distintas. Dentro do sequenciador de genes, um sistema de laser ativa as bases na sua ordem disposta, onde cada tipo de base produz uma cor de fluorescência única. Câmaras especiais capturam esses sinais fluorescentes, que eventualmente elucidam a sequência de nucleótidos dentro do gene.

Os avanços na ciência e na tecnologia têm progressivamente refinado as técnicas de sequenciação genética, passando do que agora chamamos de Sequenciação de Sanger para o mais contemporâneo Sequenciação de Nova Geração (NGS) e Sequenciação de leitura longa técnicas.

Sequenciação de Sanger

Em 1977, a chegada do método de terminação de cadeia por didioxina proposto por Sanger e do método de degradação química proposto por Gilbert assinalou o nascimento da tecnologia de sequenciamento de primeira geração. Dentre eles, o método de terminação de cadeia por didioxina de Sanger (Sequenciamento de Sanger) é o mais clássico e um dos métodos mais amplamente aplicados para detectar mutações genéticas na tecnologia de sequenciamento de Sanger. Entretanto, o método de degradação química foi gradualmente sendo descontinuado. O sequenciamento de Sanger, que visa a área específica do DNA molde através de primers específicos e incorpora nucleotídeos didioxina (ddNTP) na reação de PCR, separa os produtos de extensão por eletroforese e detecta marcadores fluorescentes, obtendo assim as informações de base em cada posição e, consequentemente, identificando mutações específicas na sequência de DNA (Fig. 6). Considerado o "padrão ouro" do sequenciamento, o sequenciamento de Sanger apresenta uma maior precisão de sequenciamento do que NGS e TGS. Além disso, oferece uma precisão refinada para comprimentos de leitura de 700-1000 pb e consegue lidar habilmente com sequências repetitivas. No entanto, suas principais limitações são a capacidade de examinar apenas um molde de cada vez, e é comparativamente mais lento e mais demorado (Zhang et al., 2021).

Figura 6 Processo de sequenciação Sanger (Zhang et al., 2021)

2. NGS

A Sequenciação de Nova Geração (NGS) baseia-se na tecnologia de PCR e na fundação de chips genéticos, utilizando tecnologia de sequenciação paralela de alto rendimento. Permite a síntese simultânea de milhões de cadeias complementares de templados sequenciados e acumula dados de sequência. A NGS emprega principalmente as tecnologias de sequenciação por síntese (SBS) e sequenciação por ligação (SBL). Atualmente, os sistemas de sequenciação Illumina tornaram-se o produto NGS dominante. A NGS determina a sequência de DNA capturando a etiqueta especial transportada pelas bases recém-adicionadas durante o processo de replicação do DNA, que frequentemente é um marcador molecular fluorescente. O processo geral pode ser dividido em quatro etapas principais: preparação da biblioteca, geração de clusters de DNA, sequenciação por síntese e análise de dados. Duas características importantes da NGS são o alto rendimento e o curto comprimento das leituras. A sua eficiência e os baixos custos de sequenciação por base oferecem vantagens incomensuráveis para aplicações clínicas.

3. Sequenciação de Leitura Longa

Sequenciação de leitura longa representa um marco no domínio da tecnologia de sequenciação. Esta tecnologia emergente, baseada na Sequenciação de Moléculas Únicas (SMS) e na tecnologia de sequenciação em massa paralela, dispensa a necessidade de amplificação por PCR de moléculas de DNA durante a sequenciação. Está fundamentada na análise de sinais de reações elétricas ou químicas individuais com base em uma única molécula, permitindo assim a sequenciação separada de cada molécula de DNA. Enquanto Ptecnologia acBio e Tecnologia de nanoporo estão incluídos na Sequenciação de Longas Leituras, um exemplo desta tecnologia, o sistema Nanopore, que fixa proteínas de nanopore numa membrana resistiva. Quando os ácidos nucleicos passam pelo nanopore, ocorrem alterações na carga elétrica. Como o diâmetro dos nanopores é extremamente pequeno, permitindo que apenas um único polímero de ácido nucleico passe de cada vez, diferentes bases interferem na corrente de maneiras distintas ao passar pela proteína nanopore. O monitoramento em tempo real e a decodificação desses sinais de corrente determinam então as sequências de bases. A Sequenciação de Longas Leituras, dada a sua maior extensão de leitura de sequências, pode sequenciar amostras de DNA originais diretamente, detectar sequências de RNA e DNA metilado diretamente, e tem a vantagem de operação rápida.

Hibridação

1. PEIXE

Em 1986, os investigadores começaram a utilizar isotiocianato de fluoresceína para rotular sondas, que foram posteriormente analisadas sob um microscópio de fluorescência, estabelecendo a técnica de Hibridização In Situ por Fluorescência (FISH). Neste processo, ácidos nucleicos exógenos (comumente referidos como sondas moleculares) emparelham-se com DNA ou RNA alvo em células ou tecidos, seguindo o princípio da complementaridade de bases, formando moléculas híbridas de ácidos nucleicos. As sondas são tipicamente rotuladas com uma molécula de reporte, como biotina ou digoxina, em um nucleótido específico. Este rótulo provoca uma reação química com substâncias de afinidade específica marcadas com fluoresceína, permitindo a captura dos sinais das sondas sob um microscópio de fluorescência. Consequentemente, torna-se viável determinar se as amostras alvo sofreram mutações genéticas.

2. Microanálise de genes

A tecnologia de microarranjos de genes, tendo experienciado um rápido desenvolvimento desde meados da década de 1990, destaca-se como uma técnica avançada de biologia molecular na interseção da síntese interdisciplinar. Aplicada principalmente no diagnóstico e tratamento de doenças, bem como na investigação farmacêutica, esta ciência inovadora tornou-se uma força fundamental na investigação biomédica contemporânea. O princípio fundamental subjacente a esta tecnologia envolve a determinação da sequência de ácidos nucleicos através da hibridização de sequências de ácidos nucleicos marcadas com fluorescência, com um conjunto de sequências conhecidas a atuar como sondas fixadas em um substrato sólido. Especificamente, quando uma solução contém uma sequência de ácido nucleico marcada com fluorescência, como TATGCAATCTAG, e esta passa por uma correspondência complementar com a sonda de ácido nucleico correspondente imobilizada numa posição específica no microarranjo de genes, a sonda que exibe a maior intensidade de fluorescência fornece informações sobre a complementaridade da sequência.

Referências:

1. Athanasopoulou K, Boti M A, Adamopoulos P G, et al. Sequenciação de terceira geração: a ponta de lança para a transformação radical da genómica moderna. Vida, 2021, 12(1): 30.
2. Boonbanjong P, Treerattrakoon K, Waiwinya W, et al. Tecnologia de amplificação isotérmica para diagnóstico de doenças. Biossensores, 2022, 12(9): 677.
3. Cao Y, Yu M, Dong G, et al. PCR digital como uma ferramenta emergente para o monitoramento da biodegradação microbiana. Moléculas, 2020, 25(3): 706.
4. Nguyen-Dumont T, Jordheim L P, Michelon J, et al. Detecção da expressão alélica diferencial utilizando análise de curva de fusão de alta resolução: aplicação ao gene de suscetibilidade ao câncer da mama CHEK2. BMC Genómica Médica, 2011, 4: 1-10.
5. Peng B, Wang Q, Luo Y, et al. Um método novo e rápido baseado em PCR para genotipar ratos com uma mutação do receptor de leptina (ratos db/db). Acta Pharmacologica Sinica, 2018, 39(1): 117-123.
6. Ye S, Dhillon S, Ke X, et al. Um procedimento eficiente para genotipagem de polimorfismos de nucleotídeo único. Pesquisa em ácidos nucleicos, 2001, 29(17): e88-e88.
7. Zhang L, Chen F X, Zeng Z, et al. Avanços em metagenómica e a sua aplicação em microrganismos ambientais. Fronteiras em microbiologia, 2021, 12: 766364.