Perspectivas Abrangentes sobre a Análise da Metilação do DNA: Locais, Métodos de Detecção e Tendências de Pesquisa Actuais

O que é a metilação do DNA?

O termo Metilação do DNA refere-se ao processo enzimático onde um grupo metilo é transferido do S-adenosilmetionina (SAM) para uma base particular na molécula de DNA, citosina (C), adenina (A) e guanina (G) sob a ação da DNA metiltransferase. Este processo induz alterações na estrutura da cromatina, conformação do DNA, estabilidade do DNA e na interação entre o DNA e as proteínas, modulando assim a expressão génica. Sendo uma forma de modificação relativamente estável, a metilação do DNA pode ser herdada através da replicação do DNA sob a ação da DNA metiltransferase, tornando-se um mecanismo crítico na epigenética. Portanto, a metilação do DNA fornece um método único de modificar a atividade génica sem alterar a sequência do DNA em si.

O Princípio da Metilação do DNA

Metilação do DNA simboliza um processo crítico de modificação epigenética. Este procedimento é catalisado por metiltransferases de DNA, que utilizam S-adenosilmetionina como doador de metilo e a acrescentam seletivamente à citosina nos dois nucleótidos do CG do DNA. O principal resultado deste processo é a formação de 5-metilcitosina. Ocasionalmente, este processo também resulta na produção de pequenas quantidades de N6-metiladenina e 7-metilguanina.

No genoma, aproximadamente 60% a 90% dos locais CpG estão sujeitos a metilação, e os CpGs não metilados aglomeram-se em ilhas CpG. Curiosamente, estas ilhas CpG estão tipicamente localizadas dentro das sequências centrais dos promotores de genes estruturais e dos locais de início de transcrição. Esta disposição acrescenta uma faceta intrigante ao panorama da regulação genómica e da expressão génica.

Notavelmente, a metilação do DNA pode induzir alterações estruturais na cromatina nas regiões correspondentes do genoma, levando ao desaparecimento de locais de clivagem para nucleases e enzimas de restrição dentro do DNA. Esta modificação resulta na cromatina tornando-se altamente espiralada e condensada, perdendo assim a sua atividade transcricional. Além disso, a citosina metilada na posição 5 pode se transformar em timina sob o efeito da desaminação. Esta transformação pode potencialmente levar a mutações de haplótipos genéticos e incompatibilidades de bases, como T2G. Se tais mutações não forem corrigidas durante o processo de divisão celular, podem instigar doenças hereditárias ou câncer.

É importante enfatizar que a metilação em organismos vivos é um processo estável e hereditário. Esta característica desempenha um papel crucial na preservação da estabilidade genética e da funcionalidade normal das células.

Dentro do DNA de organismos eucarióticos, a 5-metilcitosina é a única base quimicamente modificada. Os seus principais locais de metilação estão concentrados nos clusters de dinucleotídeos CG, apresentando uma distribuição não uniforme por todo o genoma, designando assim regiões de alta metilação, baixa metilação e não metilação. Nos mamíferos, a mC constitui aproximadamente 2-7% do conteúdo total de citosina. Metilação do DNA representa uma faceta significativa da modificação epigenética, exercendo uma influência na expressão genética sem alterar a sequência do DNA. Faz parte da codificação extragenética e é, portanto, um mecanismo chave da herança extragenética.

Durante a metilação do DNA, um grupo metilo é adicionado à molécula de DNA, como no carbono 5' do anel de citosina. Este padrão de metilação 5' é observado em todos os vertebrados. Aproximadamente 1% das bases do DNA nas células humanas sofrem metilação. Em células somáticas maduras, a metilação do DNA ocorre principalmente nos locais dinucleotídicos CpG, enquanto a metilação não CpG é comumente observada em células-tronco embrionárias. Nas plantas, a metilação da citosina pode assumir a forma de CpG simétrico (ou CpNpG) ou CpNpNp assimétrico (onde C e G denotam bases, p designa um grupo fosfato e N representa qualquer nucleotídeo).

O estado de metilação de citosinas específicas pode ser detetado através de sequenciação com bisulfito. A metilação do DNA, se presente, pode resultar no silenciamento de genes e, consequentemente, levar à disfunção. No entanto, a metilação do DNA está ausente em certas espécies.

Por que é crítico estudar a metilação do DNA

Metilação do DNA desempenha um papel fundamental na regulação da expressão genética, portanto, investigá-lo pode, no mínimo, oferecer insights valiosos sobre os mecanismos que controlam as expressões genéticas. De facto, a metilação do DNA é instrumental em numerosos processos biológicos vitais, abrangendo, mas não se limitando a, desenvolvimento embrionário precoce, impressão genética, inativação do cromossoma X, silenciamento de sequências repetitivas, juntamente com a origem, progressão e metástase do câncer. Uma exploração aprofundada da metilação do DNA permite-nos compreender os mecanismos fundamentais desses processos que sustentam a vida de forma mais adequada.

Além disso, Metilação do DNA exibe aplicações significativas na investigação médica, particularmente como um biomarcador para o câncer. Por exemplo, a metilação do Septin9 é amplamente utilizada como biomarcador para o câncer colorretal, entre outros, e o seu uso é amplamente reconhecido na prática clínica. Isto não só exemplifica as potenciais vantagens da metilação do DNA no diagnóstico de doenças, mas também abre caminho para as suas amplas perspetivas futuras na investigação médica e em potenciais tratamentos.

Padrões de metilação do DNA em tecidos normais e tumorais

Qual é a Extensão da Metilação do DNA

Para aprofundar a compreensão do ser humano. Metilação do DNA, precisamos avaliar as suas características fundamentais de distribuição dentro do genoma humano. O genoma humano compreende aproximadamente três mil milhões de pares de bases, onde cerca de 28 milhões de dinucleotídeos CpG são os principais locais de metilação do DNA. Estima-se que aproximadamente 60% a 80% destes dinucleotídeos CpG sofram metilação. Notavelmente, certas áreas, como as regiões promotoras, contêm locais de CpG de alta densidade, denominados ilhas CpG, que normalmente não apresentam metilação. No entanto, nas células tumorais, o nível geral de metilação diminui acentuadamente, variando entre 20% e 50%. Comparado às células normais, cerca de 10% a 60% dos locais de CpG nas células tumorais exibem estados de metilação alterados, equivalentes a aproximadamente 2,8 milhões a 16,8 milhões de locais de CpG. Esta alteração sugere que, apesar da diminuição nos níveis gerais de metilação nas células tumorais, os níveis de metilação dos locais de CpG nas regiões promotoras dos genes apresentam, na verdade, um aumento claro.

Como Analisar a Metilação do DNA

Descrição breve dos métodos de deteção da metilação do DNA.

Que técnica é utilizada para detectar a metilação do DNA?

Método de Detecção de Metilação de DNA em Detalhe

LC-MS/MS

Para avaliar de forma abrangente o nível de metilação em todo o genoma, dois métodos destacam-se: cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) e ELISA.

A LC-MS/MS envolve a digestão enzimática do DNA genómico em nucleotídeos individuais, incluindo A, T, G, C, 5mC e 5hmC. Subsequentemente, a utilização do modo de monitorização de reações múltiplas (MRM) por espectrometria de massas facilita a quantificação da abundância de cada nucleótido, permitindo assim determinar o nível de metilação do DNA (5mC%). Adicionalmente, a LC-MS/MS pode detetar 5hmC. Apesar da sua elevada precisão, este método exige instrumentação cara e envolve procedimentos operacionais complexos. Dada a sua precisão e sensibilidade, a LC-MS/MS serve como o padrão ouro para avaliar o conteúdo de 5mC em todo o genoma.

Embora a cromatografia líquida de alta performance acoplada à espectrometria de massa garanta alta precisão, também impõe requisitos instrumentais específicos. Além disso, os desafios em garantir a conclusão das reações enzimáticas durante o processo de rotulagem por glicosilação enzimática com radioisótopos introduzem incertezas e aumentam os custos. Consequentemente, este método encontra predominantemente utilidade em contextos de pesquisa.

ELISA

Utilizando uma abordagem baseada em anticorpos, a quantificação do conteúdo de 5mC é alcançada, juntamente com a derivação dos níveis de metilação do DNA (5mC%) através da calibração de curva padrão. O método de ensaio imunoenzimático ligado a enzimas (ELISA) oferece simplicidade e rapidez, facilitado por kits de ensaio disponíveis comercialmente. No entanto, a literatura sugere que este método é mais adequado para detectar diferenças relativamente substanciais nos níveis de metilação.

Sequenciação de Metilação de DNA

Com o avanço de tecnologias de sequenciação de alto rendimento, agora somos capazes de analisar eventos como 5'-metilcitosina e modificações de histonas a nível do genoma inteiro. Estas metodologias revelam insights além do alcance dos estudos genómicos convencionais, anunciando a era de "Metilação do DNA sequenciação." Além disso, a contínua diminuição dos custos de sequenciação e os avanços iterativos nas tecnologias de sequenciação expandiram vastamente o repertório de métodos de sequenciação de metilação de DNA disponíveis.

Atualmente, os métodos de sequenciação prevalentes na pesquisa em epigenética incluem sequenciação de bisulfito de genoma completo (WGBS)preciso sequenciação de bisulfito oxidativo (oxBS-seq)versões otimizadas de sequenciação de bisulfito com representação reduzida (RRBS/dRRBS/XRBS), sequenciação de bisulfito de genoma inteiro de célula única ou de baixo input (scWGBS), sequenciação de (hidroxi)methylação baseada em amplicons, e sequenciação por imunoprecipitação de DNA de (hidroxi)methylação.hMeDIP-seq). Estas metodologias diversas oferecem soluções personalizadas para várias questões de investigação relacionadas com a metilação do DNA.

Sequenciação de Bisulfito de Genoma Inteiro

WGBS é considerado o padrão ouro em Metilação do DNA pesquisa, facilitando a deteção precisa do estado de metilação em cada base de citosina (C) em todo o genoma. Este método fornece uma base técnica vital para elucidar a dinâmica espaciotemporal das modificações de metilação do DNA genómico, encontrando assim uma ampla utilidade na desvendar das complexidades mecanicistas subjacentes ao desenvolvimento individual, envelhecimento, etiologia de doenças e além. Surge como a abordagem preferida para estudos de metiloma em diversas espécies.

As técnicas convencionais de sequenciação de metilação do genoma completo envolvem a utilização de ligase T4-DNA, que, após a fragmentação do DNA genómico por ultrassom, facilita a ligação de sequências de adaptadores em ambas as extremidades dos fragmentos de DNA. O tratamento subsequente com bisulfito converte as citosinas (C) não metiladas em uracilos (U), que são posteriormente convertidos em timinas (T) através da amplificação por PCR mediada por sequências de adaptadores.

Este artigo sobre 'Como Escolher a Tecnologia de Sequenciação de Metilação de DNAajudará a selecionar o método de teste de metilação de DNA mais apropriado.

Vantagens Principais:

Ampla Aplicabilidade: Adequado para investigação em humanos e na maioria das espécies de animais e plantas (dado os genomas de referência conhecidos).

Cobertura Genómica: Permite a aquisição abrangente de dados do metiloma, facilitando o mapeamento preciso dos padrões de metilação em todo o genoma.

Resolução de base única: Permite a capacidade de discernir precisamente o estado de metilação de cada base C individual.

Sequenciação de Metilação Simplificada (RRBS/dRRBS/XRBS)

RRBS é uma estratégia que utiliza enzimas de restrição para digerir o genoma, enriquecendo regiões regulatórias epigenéticas significativas, como promotores e ilhas CpG, seguida de sequenciamento com bisulfito. Esta técnica aumenta significativamente a profundidade de sequenciamento em regiões ricas em CpG, permitindo a deteção de alta resolução em regiões que abrangem ilhas CpG, promotores e elementos de reforço. Como uma ferramenta fiável, eficiente e económica para Metilação do DNA a pesquisa, tem uma grande aplicabilidade prospectiva em investigações clínicas com amostras de grande escala. Para nos adaptarmos às exigências em evolução da tecnologia científica, desenvolvemos o RRBS digerido por duas enzimas (dRRBS) que pode capturar locos CpG em regiões mais amplas, facilitando a exploração de áreas de metilação mais extensas, incluindo as margens de CGI.

Na tentativa de facilitar a análise multidimensional com um volume de amostra mínimo, desenvolvemos a Sequenciação de Bisulfito de Representação Estendida (XRBS), um método de sequenciação direcionado à metilação que enriquece a cobertura de ilhas CpG, promotores, potenciadores e locais de ligação do CTCF. Este método alcança alta sensibilidade e reutilização de amostras, tornando-se altamente escalável e aplicável a amostras limitadas e células únicas.

Vantagens Técnicas:

Alta precisão: capaz de resolução de base única dentro da sua faixa de cobertura.

Boa repetibilidade: A repetibilidade da área de cobertura entre várias amostras pode atingir 85%-95%, tornando-a adequada para análise diferencial entre várias amostras.

Custo-efetivo: A área de sequenciação visa regiões ricas em CpG, otimizando assim a utilização dos dados.

Sequenciação de Bisulfito de Genoma Inteiro em Célula Única (scWGBS)

O estudo da genómica da metilação do DNA em amostras de células únicas e minúsculas é frequentemente limitado pelas técnicas de sequenciação de bibliotecas. Os métodos tradicionais de construção de bibliotecas e as técnicas de amplificação do DNA do genoma de células únicas são desafiadores de aplicar dentro dos protocolos de experimentação de metilação. Utilizando uma tecnologia baseada em amplificação linear e construção de bibliotecas em tubo único, a nossa equipa conseguiu reduzir o viés da biblioteca e completar com precisão estudos de metilação do genoma completo em amostras valiosas.

A investigação sobre a metilação de células únicas e amostras extremamente raras é aplicada principalmente na exploração dos mecanismos de desenvolvimento de tumores, na investigação do câncer, no diagnóstico pré-implantação de embriões, no desenvolvimento embrionário inicial, na recombinação de células da linha germinativa, nas células-tronco e na heterogeneidade celular, entre outros. As amostras aplicáveis incluem células únicas e microcélulas.

Vantagens Técnicas:

Materiais de Partida Mínimos: Utiliza DNA de célula única ou materiais de partida extremamente mínimos para a construção da biblioteca.

Cobertura de Sequenciamento Elevada: Maximiza a extração de informações abrangentes sobre a metilação do genoma completo, mapeando com precisão a paisagem de metilação.

Resolução de Base Única: Capaz de analisar com precisão o estado de metilação de cada base de citosina.

Sequenciação Precisa por Bisulfito Oxidativo (oxBS-Seq)

A hidroximetilação do DNA foi recentemente identificada como um tipo inovador de modificação do DNA que rapidamente se tornou um ponto focal crítico de pesquisa. Com pesquisas elucidativas, foi revelado que o sequenciamento com bisulfito, anteriormente considerado o "padrão ouro" para detectar a metilação do DNA, é incapaz de distinguir entre a metilação do DNA (5mC) e a hidroximetilação do DNA (5hmC). Em colaboração, a YeeGene e a Universidade de Cambridge criaram um oxBS-Seq que pode não só detetar com precisão a metilação do DNA ao reduzir a influência da hidroximetilação do DNA, mas também determinar simultaneamente a hidroximetilação do DNA com resolução de base única através da utilização de uma combinação de duas bibliotecas.

Princípios TécnicosA oxBS-Seq oxigena 5hmC para 5fC, que pode então ser alterado para 'U' por bisulfito, permitindo assim a deteção precisa de 5mC. Simultaneamente, ao comparar com os resultados rotineiros de bisulfito, pode-se alcançar uma deteção precisa de 5hmC.

Vantagens TécnicasRe-definindo o "padrão ouro" na deteção de metilação de DNA Análise de resolução de base única das modificações de hidroximetilação de DNA em todo o genoma Validação multi-padrão apresenta alta eficiência de oxidação e taxa de conversão de bisulfito Mínimo viés experimental com reprodutibilidade excecional (R² > 0,98) Capaz de acomodar uma variedade de necessidades de aplicação de sequenciação: Sequenciação de Bisulfito de Representação Reduzida Oxidativa (oxRRBS) simplificada, sequenciação de metilação oxidativa de região alvo (Target-oxBS).

OxBS-seq exibe apenas 5mC e requer uma comparação com a sequenciação por bisulfito padrão (BS-seq) para inferir as posições de sequência e a abundância de 5hmC e 5mC. (Tibor A. Rauch, et al.) Manual de Epigenética, 2023)

Sequenciação de Metilação (Hidroximetilação) de Amplicons

O sequenciamento baseado em amplicons de metilação e hidroximetilação direciona sequências específicas de DNA no genoma, utilizando primers de amplificação específicos para metilação, como aqueles relevantes para genes de interesse particular. Após o tratamento (oxidativo) com bisulfito do DNA genómico, a amplificação via PCR precede a caracterização do estado de metilação nas regiões dos genes com um nível excecional de precisão, facilitada pelo sequenciamento de alto rendimento de nova geração.

Vantagens Técnicas:

Alta Precisão: Esta técnica é capaz de analisar de algumas a várias centenas de genes/sites CpG, alcançando uma resolução de par de bases única dentro da faixa alvo. Além disso, possui uma profundidade de cobertura superior (cobertura média do site >300X).

Custo-Eficaz: Oferecendo um baixo custo e um tempo de resposta rápido, esta técnica reúne uma excelente eficiência económica e valor científico.

Especificidade: Adequado para a deteção de estados de metilação em genes ou locais específicos.

Ampla Aplicabilidade: É amplamente utilizado em amostras clínicas para triagem de biomarcadores de metilação, validação e aplicações clínicas translacionais.

hMeDIP-Seq

hMeDIP-seq, um termo derivado da metilação do DNA, relaciona-se com a modificação inovadora da base 5hmC, formada através da oxidação de 5mC pela enzima produzida pela família TET. Não só o 5hmC tem o potencial de contribuir para o controlo da expressão genética ao diminuir a afinidade entre o DNA metilado e o Domínio de Ligação Methyl CpG (MBD) da proteína MeCP, como também desempenha um papel crucial no processo de desmetilação do DNA.

A técnica hMeDIP-Seq funciona ao explorar um anticorpo específico para 5'-hidroximetilcitosina para enriquecer fragmentos de DNA hidroximetilados. Este processo é então combinado com sequenciação de alto rendimento para localizar de forma rápida e eficiente regiões hidroximetiladas em toda a escala do genoma com um conjunto de dados menor. A sua utilidade é vasta, estendendo-se à investigação da relação entre hidroximetilação e doenças e o seu papel no desenvolvimento embrionário.

Esta tecnologia apresenta numerosas vantagens: uma ampla gama de deteção que permite a identificação de áreas de modificação metilada em todo o genoma; uma forte especificidade que possibilita a deteção direcionada de regiões com modificações metiladas dentro do genoma; e uma vantagem económica com um conjunto de dados de sequenciação reduzido, diminuindo assim os custos de sequenciação.

EM-seq

Quanto ao Enzymatic Methyl-seq (EM-seq), ele mitiga uma grande limitação do padrão ouro de longa data para a análise do metiloma, WGBSAs reações químicas do bisulfito comprometem a integridade do DNA, causando fragmentação e perda do DNA. O EM-seq supera essa desvantagem através do processamento enzimático do DNA para a construção de bibliotecas WGBS. Na primeira etapa, a enzima TET2 e agentes de aumento da oxidação transformam 5mC e 5hmC em 5-carboxilcitosina (5caC), protegendo assim as citosinas modificadas. Na segunda etapa, a deaminase APOBEC trata as citosinas sem impactar 5caC, permitindo assim a detecção de 5mC e 5hmC.

Pirosequenciação

A pirosequenciação, também conhecida como sequenciação sintética, utiliza a conversão com bisulfito seguida de pirosequenciação para detectar alterações no DNA em áreas-alvo específicas após a conversão com bisulfito. A quantificação dos níveis de 5mC é realizada comparando a razão de citosina (C) para timina (T) em loci gênicos individuais. Esta técnica de sequenciação dispensa a necessidade de qualquer forma especial de rotulagem por fluorescência ou eletroforese, oferecendo facilidade de operação. Com uma repetibilidade e precisão de sequenciação comparáveis à sequenciação de Sanger, a pirosequenciação é capaz de alcançar uma velocidade cem vezes superior. No entanto, a dependência da técnica na detecção de luminescência instantânea limita o seu maior rendimento, e a sua precisão na detecção de homopolímeros é subótima. À medida que o comprimento do homopolímero aumenta, o potencial de erro também aumenta. A pirosequenciação é mais adequada para a sequenciação rápida de sequências de DNA curtas e conhecidas, variando de 20 a 50 pares de bases.

Sequenciação assistida por TET com Borano de Piridina

A sequenciação assistida por TET com borano de piridina (TAPS) proporciona uma mudança inovadora em relação à estrutura convencional de conversão utilizando sais de bisulfito. O TAPS opta por uma abordagem mais direta, convertendo citosinas metiladas (C) em timina (T) antes da sequenciação. A conversão de C em T é facilitada através de uma combinação de reações enzimáticas e químicas. Primeiro, a enzima de oxidação TET1 converte 5mC e 5hmC em citosina 5-carboxílica (5caC). Subsequentemente, através da ação do redutor borano de piridina, isto é transformado em dihidrouracilo (DHU), um composto que serve como um template para PCR. A DNA polimerase, que pode identificar uracilo (U), reconhece o DHU. Consequentemente, após o processo de PCR, é gerado um produto de PCR que passou pela transformação de C em T.

A TAPS oferece uma vantagem distinta.: a sua abordagem não destrutiva em relação ao DNA. Reduz a perda de DNA, aumentando assim a complexidade ou cobertura dos dados de sequenciamento. Após a conversão, fragmentos de DNA de até 10 quilobases podem ser retidos, tornando o TAPS altamente aplicável para sequenciamento de terceira geração. Dada a sua forma de converter citosinas metiladas em timina, o impacto que tem no equilíbrio das bases da sequência de DNA é extremamente mínimo, o que melhora a qualidade dos dados a montante e aumenta significativamente as taxas de alinhamento dos dados. Além disso, a relação custo-eficácia da técnica TAPS prova ser superior aos métodos tradicionais de conversão por bisulfito.

Sequenciação por Nanoporos

A tecnologia de sequenciação por nanoporo aproveita as diferenças de potencial geradas quando moléculas únicas passam através de nanoporos para a deteção de sinais. O diâmetro de um nanoporo é apenas suficiente para permitir a passagem de um único polímero de ácido nucleico. As quatro bases nucleotídicas adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G) - incluindo aquelas adornadas com modificações de metilação - possuem propriedades de carga distintas. Consequentemente, os nucleotídeos com modificações de metilação e os seus homólogos não modificados exibem características de sinal elétrico distintas à medida que atravessam o nanoporo. Assim, modelos computacionais avançados, como o aprendizado profundo, podem capturar os padrões de sinal elétrico distintivos de moléculas metiladas, abrindo caminho para a criação de ferramentas capazes de detectar modificações de metilação molecular de DNA/RNA com base nos sinais de sequenciação de ONT.

Chip de Metilação de DNA

Em grande escala, genoma completo Metilação do DNA estudos, o método do chip de metilação do DNA é mais viável em comparação com WGBS devido aos altos custos associados ao sequenciamento e ao processamento de dados. Um chip de metilação de DNA envolve a hibridização de uma sonda de DNA tratada com bisulfito, transformando-a em locos CpG enriquecidos em citosina de interesse (tanto metilados como não metilados).

O chip 450K realiza a conversão de bisulfito em 0,5-1μg de DNA genómico. O DNA convertido hibridiza então com uma matriz de duas sondas pré-projetadas, específicas para metilação: metiladas e não metiladas. A base única da sonda liga-se a nucleotídeos marcados e tingidos com fluorescência (ddNTP) no local CpG 3'. O chip de beads é então digitalizado num Illumina iScan para detetar a proporção de sinais fluorescentes. A proporção de metilação do DNA em cada local CpG é denominada β-value (β), calculada como M/(M+U+100), onde M é a intensidade do sinal de metilação, U é a intensidade do sinal não metilado, e 100 é um offset constante utilizado para ajustar os β-values quando as intensidades de ambas as citosinas metiladas e não metiladas são baixas. Um β-value de 0 significa 0% de metilação, e 1 indica 100% de metilação no local CpG alvo.

A tecnologia de chip de metilação emergiu como uma ferramenta vital na pesquisa de metilação do DNA. Comparado com a sequenciação de metilação de genoma completo, a deteção por chip apresenta requisitos de iniciação mais baixos, ciclos mais curtos e a capacidade de contornar as limitações do tipo de amostra, provando ser aplicável a amostras fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) e a espécimes clínicos valiosos. Esses benefícios tornaram a tecnologia um "bolo quente" no campo da deteção de metilação. Dispositivos como o Infinium Human Methylation 450 e o Methylation EPIC v1.0 (850K) têm sido amplamente utilizados para a coleta de dados de associação em todo o epigenoma em estudos publicados, mostrando uma tendência de aumento constante ano após ano.

Abordagem específica de genes

PCR específica para metilação, MSP

O MSP, este processo permite uma avaliação qualitativa rápida do estado de metilação em qualquer grupo de locais CpG dentro de ilhas CpG. A principal vantagem do MSP reside na sua simplicidade e rapidez. Se o objetivo for a quantificação relativa, pode-se usar a rotulagem com corantes fluorescentes e, através da metodologia qMSP, ler diretamente os valores de fluorescência e os valores de Ct para representar os níveis de metilação.

O princípio do MSP (J G Herman et al., 1996)

MethyLight

Além disso, métodos baseados em sondas fluorescentes, como o MethyLight, podem ser utilizados. Os primers específicos para metilação estão conjugados com o grupo fluorescente FAM na extremidade 5', enquanto os primers específicos para não metilação têm VIC, outro grupo fluorescente, conjugado na extremidade 5'. A PCR em tempo real liberta fluxos constantes de FAM e VIC, permitindo a identificação dos estados de metilação através da deteção destes dois. O grau de metilação é determinado quantitativamente medindo os valores de Ct. Cada reação de PCR requer menos de 100ng de DNA convertido em bisulfito, enquanto os resultados quantitativos podem ser calculados utilizando produtos padrão.

Princípio do MethyLight (Anetta Sulewska) et al.,. 2007)

dPCR

A Reacção em Cadeia da Polimerase Digital (dPCR) é uma abordagem de quantificação absoluta de ácidos nucleicos em rápido desenvolvimento, baseada em princípios de contagem de singularidades. Está a ser progressivamente utilizada na quantificação de amostras de metilação em traços ou de baixo nível. A utilização deste método para a deteção de metilação apresenta várias vantagens distintas, incluindo:

1) Alta sensibilidade: a dPCR permite a deteção direta de metilação a nível de uma única molécula dentro de uma vasta gama de micro-unidades de reação, contornando a necessidade de vetores de subclonagem exigidos na sequenciação de Sanger. Isto é particularmente adequado para a deteção de amostras com baixa abundância ou locais de metilação raros.

2) Quantificação direta: Ao contrário do MethyLight, a dPCR elimina a necessidade de construir curvas padrão. Ela quantifica diretamente as concentrações de número de cópias de amostras de DNA metilado, resultando em resultados de quantificação menos afetados pela eficiência da amplificação PCR.

3) Forte capacidade de anti-interferência: Ao distribuir a amostra de forma uniforme em milhares de micro-unidades de reação, os inibidores de PCR presentes nas amostras são significativamente diluídos, minimizando assim a interferência nas reações de PCR.

À luz dessas características, a PCR digital é excepcionalmente adequada para a triagem e validação dos níveis de metilação em amostras de DNA em traços dentro de matrizes complexas, como amostras embebidas em parafina ou amostras de DNA circulante livre (cfDNA) derivadas do plasma. Consequentemente, um número crescente de investigadores está a adotar técnicas de PCR digital na deteção de metilação do DNA.

Amplificação por PCR em tempo real baseada em MethyLight digital. (Daniel J Weisenberger) et al.,. 2008)

Digestão com Enzimas de Restrição de Metilação

Este método aproveita a propriedade das endonucleases de restrição de metilação para deixar as regiões metiladas indigestas, fragmentando assim o ADN em segmentos de tamanhos diferentes para análise subsequente. HpaII-MspI, que reconhece a sequência CCGG, é um par representativo de enzimas normalmente utilizado para esta tarefa. Subsequentemente, os produtos isolados são submetidos a blotting de Southern ou amplificação por PCR para determinar o estado de metilação dos fragmentos alvo.

Probes metilados e não metilados, projetados respetivamente com secções de oligonucleotídeos contendo sequências híbridas de comprimento variável, são hibridizados separadamente com o DNA de teste. Os probes ligados ao DNA são conectados por uma ligase. Se existirem locais de metilação no fragmento de DNA, o probe com o sítio de reconhecimento HpaII não pode ser clivado. Por outro lado, se o DNA não estiver metilado, o fragmento é clivado por HpaII e o probe não pode ser ligado. Assim, no processo subsequente de amplificação por PCR, apenas os probes ligados podem ser amplificados. A análise final dos fragmentos amplificados revela a condição de metilação de locais específicos no DNA original.

Este método apresenta várias vantagens: Em primeiro lugar, a necessidade de volume de amostra é mínima. Devido às curtas sequências de reconhecimento das sondas, este método é adequado para DNA decomposto locorregionalmente, como amostras de DNA incorporadas em parafina. Também é aplicável para analisar grandes quantidades de amostras mistas. A limitação deste método reside no local de ligação da sonda ser restringido pelo local de reconhecimento da endonuclease de restrição. Além disso, a temperatura de reação ótima da enzima utilizada deve ser considerada.

Amplificação por sondas dependentes de ligadura multiplex específica de metilação (MS-MLPA)
(Cornelia Hömig-Hölzel) et al.,. 2012)

Gestão de Recursos Humanos (GRH)

A Análise de Derretimento de Alta Resolução (HRM) foi inicialmente utilizada para genotipagem de Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs) e foi alargada para detectar alterações de metilação em DNA submetido a tratamento com bisulfito. Ao utilizar corantes fluorescentes específicos, identifica as disparidades em bases únicas através das suas características de desnaturação diferencial. As diferenças subtis entre 5-metilcitosina e citosina manifestam-se como alterações de base única no DNA após o tratamento com bisulfito de sódio. Os níveis de metilação das amostras testadas podem ser estimados comparando as suas curvas de desnaturação com uma série de curvas de controlo obtidas a partir de amostras com percentagens conhecidas de metilação e não metilação. Isto pode ser alcançado com o cuidadoso design de primers para mitigar o viés da PCR.

Diagrama esquemático da deteção de metilação por fusão de alta resolução (HRM) (Dianna Hussmann.; Lise Lotte Hansen. 2018)

Enriquecimento de afinidade

As técnicas de enriquecimento por afinidade, incluindo a Imunoprecipitação de DNA Metilado (MeDIP) e a captura de proteínas de domínio de ligação a metilo (MBD Cap), desempenham papéis significativos em Metilação do DNA detecção. O MeDIP utiliza um anticorpo específico para 5-metilcitosina para enriquecer fragmentos metilados após a fragmentação e desnaturação do DNA. Os fragmentos imunoprecipitados podem ser sequenciados para uma análise adicional após isolamento e purificação. A técnica MBD Cap, semelhante ao MeDIP, aproveita proteínas de ligação à metilação do DNA para a imunoprecipitação de DNA metilado. Embora sejam semelhantes, as proteínas enriquecidas diferem na medida em que o MeDIP geralmente se concentra em regiões hipometiladas com baixa densidade de CpG, enquanto o MBD Cap tipicamente enriquece regiões altamente metiladas com alta densidade de CpG. Essas variações tornam ambas as técnicas inestimáveis nas suas aplicações únicas na pesquisa sobre metilação do DNA.

Metodologias baseadas em afinidade. MeDIP: Imunoprecipitação de DNA metilado; MIRA: Assay de recuperação de CGI metilados; MBD: Domínio de ligação a metilo. (Kristen Taylor) et al.,. 2010)

MassArray

A tecnologia do sistema de análise genética MassARRAY combina os princípios da reação de clivagem enzimática específica de base (MassCLEAVE) e sequenciação MALDI-TOF. Semelhante a outros métodos de deteção de metilação do DNA, a plataforma MassARRAY aplica DNA tratado com sulfito, onde a citosina (C) não metilada é convertida em uracilo (U), enquanto a citosina metilada permanece inalterada. As citosinas metiladas e não metiladas (transformadas em U) podem ser diferenciadas devido aos seus distintos pesos moleculares. Os produtos de deteção resultantes com pesos moleculares distintos são transcodificados e submetidos a uma reação de clivagem enzimática específica de base (MassCLEAVE). Os pesos moleculares dos fragmentos metilados e não metilados são diferentes (distinguíveis com base na diferença de 16Da entre a base G e a base A), permitindo o cálculo da razão de metilação através da espectrometria de massa por tempo de voo. O MassARRAY oferece alta capacidade de processamento, baixo custo e alta sensibilidade. No entanto, é necessário equipamento especial e não consegue detectar mutações desconhecidas. Além disso, requer conversão e amplificação por PCR, e cada teste tem requisitos específicos em relação ao número de amostras e locais.

Tecnologia MassARRAY da Sequenom para a Análise da Metilação do DNA (Enrique J. Busó) et al.,. Biomarcadores e Diagnósticos Epigenéticos 2016)

Aplicação de Pesquisa em Metilação de DNA

Investigação Fundamental: Foco na Patogénese da Doença

a. Cancro: Alterações nos níveis de metilação de numerosos genes associados a tumores levam ao silenciamento ou superexpressão de genes, contribuindo para a tumorigenese. Por exemplo, no cancro da mama, genes supressores de tumores como BRCA1 e TP53 frequentemente sofrem Metilação do DNA, resultando em expressão gênica reduzida ou perdida, elevando assim o risco de tumorigenese. Além disso, níveis aberrantes de metilação do DNA estão intimamente associados à malignidade e prognóstico dos tumores. Estudos revelaram que tecidos tumorais altamente metilados geralmente apresentam taxas de sobrevivência mais baixas e maiores riscos metastáticos em comparação com tecidos com níveis de metilação mais baixos. Assim, a metilação do DNA tem implicações significativas para a triagem precoce e diagnóstico do câncer.

b. Doenças Cardiovasculares: A expressão desregulada de genes metilados e as alterações nos níveis de metilação do DNA estão intimamente ligadas à ocorrência de doenças cardiovasculares, como hipertensão, doença arterial coronária e enfarte do miocárdio.

c. Doenças Genéticas: Algumas doenças monogénicas hereditárias, como a fibrose quística e a hemofilia, podem ser diagnosticadas através da metilação.

d. Transtornos Mentais: A metilação do DNA pode também estar implicada na patogénese de transtornos mentais como o autismo e a esquizofrenia.

e. Doenças Autoimunes: Estudos sugerem que a metilação do DNA pode desempenhar um papel em doenças autoimunes como a artrite reumatoide e o lúpus eritematoso sistémico.

Investigação Médica Translacional: Foco em Biomarcadores de Doenças

a. Detecção de Câncer: A metilação do DNA representa um domínio crucial na pesquisa do câncer, caracterizado por padrões de metilação únicos em vários tipos de câncer. A avaliação do estado de metilação do DNA em tecidos tumorais pode ser utilizada para diagnóstico precoce, avaliação de prognóstico e monitorização de recidivas. Por exemplo, no câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de mama e outras malignidades, a previsão das taxas de sobrevivência dos pacientes e dos riscos de recidiva pode ser alcançada através da deteção do estado de metilação em genes específicos.

b. Detecção de Doenças Genéticas: A metilação do DNA encontra aplicações na deteção de doenças genéticas. Por exemplo, a análise do estado de metilação de certos genes ajuda no diagnóstico e rastreio de doenças monogénicas hereditárias, como a fibrose quística e a hemofilia.

c. Detecção de Transtornos Mentais: Pesquisas sugerem uma associação potencial entre a metilação do DNA e o início de transtornos mentais, como o autismo e a esquizofrenia. O perfil da metilação do DNA em indivíduos com transtornos mentais contribui para uma compreensão mais profunda da sua patogénese, oferecendo assim novas perspetivas e abordagens para diagnóstico e tratamento.

No domínio da reprodução de animais e plantas, foram feitos progressos significativos, aproveitando os avanços na biologia molecular e na ciência ambiental.

No domínio da reprodução de animais e plantas:

Pesquisa Fundamental: A investigação sobre os padrões de metilação das espécies e a sua correlação com vários fenómenos biológicos, como crescimento, desenvolvimento, resistência a doenças, capacidades reprodutivas, desenvolvimento embrionário precoce e senescência, é um pilar fundamental.

Marcadores Moleculares: A utilização da metilação do DNA como um marcador molecular facilita aos criadores a seleção de indivíduos que apresentam características desejáveis, como resistência a doenças, resistência a pragas e alta produtividade.

Edição Genómica: A modulação dos padrões de metilação dos genomas de animais e plantas permite uma regulação precisa da expressão génica, melhorando assim as características desejadas nestes organismos.

Voltando ao aspecto ambiental:

Fitorremediação: Certas espécies de plantas possuem a capacidade de acumular poluentes. Ao manipular o estado de metilação dessas plantas, a sua capacidade de absorver e degradar poluentes pode ser aumentada, facilitando assim os esforços de fitorremediação.

Degradação Microbiana: Aproveitar a degradação microbiana de poluentes orgânicos é uma abordagem fundamental na remediação ambiental. Manipular o estado de metilação dos microrganismos pode aumentar a sua capacidade de degradar poluentes.

Estudos Ecológicos Moleculares: A exploração da metilação do DNA na elucidação da estrutura, função e padrões de sucessão das comunidades microbianas em ambientes poluídos contribui para uma compreensão abrangente das características ecológicas desses ambientes, oferecendo uma base teórica para estratégias de gestão da poluição.

Referências:

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