MeDIP-seq vs. RRBS vs. WGBS

A metilação do DNA, um processo epigenético essencial, desempenha um papel crítico na regulação genética e em vários processos biológicos. A densidade de CpG, a frequência de dinucleotídeos CpG em uma determinada região genómica, emergiu como um fator crucial na análise da metilação do DNA. Diferentes técnicas moleculares foram desenvolvidas para investigar padrões de metilação do DNA em genomas. Neste artigo, pretendemos comparar três métodos amplamente utilizados: Imunoprecipitação de DNA metilado seguida de sequenciação (MeDIP-Seq)Sequenciação de Bisulfito com Representação Reduzida (RRBS) e Sequenciação de Bisulfito de Genoma Inteiro (WGBS). Analisamos as suas preferências por diferentes regiões de densidade de CpG e destacamos os seus pontos fortes e limitações na análise de metilação do DNA.

Densidade de CpG e Padrões de Metilação do DNA Através das Espécies

As regiões genómicas podem ser classificadas em diferentes categorias com base na sua densidade de CpG, como ilhas de CpG (CGIs), margens de CpG, prateleiras de CpG e prateleiras continentais de CpG. Análises anteriores em todo o genoma em diversas espécies, incluindo humanos, ratos, aves e peixes, mostraram que a maioria das regiões genómicas pertence à categoria de baixa densidade (1-3 CpG/100bp). As regiões de alta densidade (>5 CpG/100bp) representam menos de 10% do genoma.

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Densidade de CpG em todo o genoma. (Beck et al., 2022)

MeDIP-seq

MeDIP-seq (Imunoprecipitação de DNA Metilado seguida de sequenciação) é uma técnica epigenómica amplamente utilizada que permite a análise em todo o genoma dos padrões de metilação do DNA a um custo reduzido em comparação com outros métodos de alta resolução. Este método envolve uma série de etapas para enriquecer fragmentos de DNA metilado, seguidas de sequenciação para gerar perfis de metilação do DNA em todo o genoma. MeDIP-Seq usa um anticorpo anti-5-metilcitosina para enriquecer regiões de DNA metiladas, seguido de sequenciação de nova geração. O MeDIP-Seq direciona-se predominantemente a regiões de baixa densidade de CpG (<5 CpG/100bp), cobrindo mais de 95% do genoma. Fornece uma visão geral ampla dos padrões de metilação do DNA, mas carece de resolução a nível de base única.

Sequenciação por imunoprecipitação de DNA metilado (MeDIP-Seq). (Beck et al., 2022)

Apesar da sua utilidade, o MeDIP-seq tem algumas limitações das quais os investigadores devem estar cientes.

• Falta de Resolução de Base Única

Uma das principais limitações do MeDIP-seq é a sua incapacidade de fornecer resolução a nível de base única. Uma vez que o DNA é fragmentado em várias centenas de pares de bases durante a sonicação, a localização exata dos locais individuais de metilação de CpG não pode ser determinada. Em vez disso, o MeDIP-seq fornece informações sobre o estado geral de metilação do DNA dentro de regiões que contêm locais de CpG metilados.

• Não é um Método de Sequenciação de Alto Rendimento

Comparado a outros métodos de sequenciação, como a Sequenciação de Bisulfito de Genoma Inteiro (WGBS), o MeDIP-seq não é considerado uma técnica de alto rendimento. Isto porque visa seletivamente fragmentos de DNA metilados, em vez de sequenciar todo o genoma. Consequentemente, o MeDIP-seq pode não fornecer uma cobertura tão abrangente do genoma como o WGBS.

• Identificação Limitada dos Níveis Individuais de Metilação de CpG

MeDIP-seq fornece informações sobre a presença de fragmentos de DNA metilados, mas não mede diretamente o nível de metilação de CpG em cada sítio. Consequentemente, não consegue distinguir entre diferentes graus de metilação (por exemplo, 50% de metilação versus 80% de metilação) em sítios individuais de CpG.

• Desafios na Análise de Regiões de CpG de Alta Densidade

O MeDIP-seq pode enfrentar dificuldades ao analisar regiões com altas densidades de locais CpG. A eficiência de ligação do anticorpo pode variar para regiões densamente metiladas, levando a potenciais vieses na análise.

RRBS e WGBS

RRBS (Sequenciamento de Bisulfito de Representação Reduzida) e WGBS (Sequenciação de Bisulfito de Todo o Genoma) são técnicas avançadas de sequenciação de metilação de DNA conhecidas pela sua capacidade de alcançar resolução de base única.

RRBS é uma técnica de perfilagem de metilação de DNA direcionada que combina tratamento com bisulfito e sequenciação de nova geração. Foca em regiões ricas em CpG utilizando enzimas de restrição para fragmentar o DNA genómico antes da conversão com bisulfito, permitindo que os investigadores analisem um subconjunto representativo do genoma com maior resolução do que o MeDIP-seq. RRBS envolve um processo em duas etapas. Inicialmente, endonucleases de restrição sensíveis à metilação são utilizadas para clivar enzimaticamente o DNA não metilado em locais específicos de CpG com alta densidade de GC, resultando em fragmentos de DNA. Estes fragmentos são então cuidadosamente selecionados com base no tamanho e direcionados para regiões como promotores e ilhas de CpG. Subsequentemente, os fragmentos passam por conversão sulfítica, que transforma a citosina não metilada em uracilo, preservando a citosina metilada. Após isso, são realizadas amplificação por PCR e sequenciação desses fragmentos.

Representação reduzida de bisulfito (RRBS). (Beck et al., 2022)

Por outro lado, o WGBS envolve submeter todo o genoma a um tratamento com sulfito sem a prévia isolação de fragmentos metilados. WGBS é considerado o padrão ouro para o estudo da metilação do DNA, pois fornece resolução de par de bases em todo o genoma. Envolve a conversão de bisulfito do DNA genómico, que converte citosinas não metiladas em uracilos, enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. O sequenciamento subsequente permite a identificação precisa de citosinas metiladas e não metiladas, proporcionando uma imagem abrangente e detalhada da paisagem de metilação do DNA. Durante a conversão de sulfito, as citosinas não metiladas são convertidas em uracilo, enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. O DNA pós-conversão é então sequenciado, e diversos protocolos de bioinformática são empregados, frequentemente levando a uma caracterização abrangente do genoma.

Bisulfito de genoma completo (WGBS). (Beck et al., 2022)

Comparação dos Resultados de Dados de Sequenciação

• Análise MeDIP-seq

A análise MeDIP-seq produziu descobertas intrigantes sobre a distribuição da densidade de CpG em diversas espécies. A análise dos dados revelou que a maioria das regiões diferencialmente metiladas (DMRs) identificadas nos conjuntos de dados MeDIP-seq estava principalmente associada a regiões de baixa densidade de CpG, especificamente dentro da faixa de 0-3 sítios de CpG por 100 pares de bases (pb). Notavelmente, foi observada uma densidade de CpG prevalente de 1 sítio de CpG por 100 pb, que estava intimamente correlacionada com a densidade predominante dentro do genoma representativo.

esses resultados sugerem fortemente que o MeDIP-seq apresenta uma propensão para interrogar regiões genómicas caracterizadas por baixa densidade de CpG, capturando assim de forma eficaz as alterações na metilação que ocorrem nessas áreas. Essas regiões de baixa densidade de CpG estão amplamente distribuídas e abrangem mais de 90% dos genomas de várias espécies. Consequentemente, MeDIP-seq é um método bem adequado para investigar padrões de metilação do DNA dentro destas regiões, proporcionando assim uma visão abrangente da dinâmica de metilação em todo o genoma.

Não obstante, é digno de nota que algumas variações na distribuição da densidade de CpG foram observadas ao comparar amostras de diferentes espécies. Por exemplo, a análise dos DMRs de zebrafish indicou uma mudança para densidades de CpG ligeiramente mais altas, especificamente dentro da faixa de 1-4 sítios de CpG por 100 bp. Esta mudança pode ser atribuída à presença de dois tipos celulares distintos, espermatozoides e eritrócitos, nas amostras de zebrafish, cada um potencialmente exibindo padrões de metilação únicos.

• Análise RRBS

A análise RRBS (Sequenciação de Bisulfito de Representação Reduzida) realizada em diversas espécies revelou descobertas intrigantes sobre a distribuição da densidade de CpG nos conjuntos de dados adquiridos. Especificamente, as regiões diferencialmente metiladas (DMRs) identificadas através da RRBS exibiram uma bifurcação distinta nas densidades de CpG. Certos conjuntos de dados mostraram uma mudança para densidades de CpG mais elevadas, particularmente na faixa de >10 CpG/100bp, enquanto outros demonstraram uma preferência por densidades de CpG intermédias.

Após uma análise mais detalhada, revelou-se que, dentro dos conjuntos de dados RRBS com densidades de CpG superiores a 10 CpG/100bp, a densidade dominante era de 10-12 CpG/100bp. No entanto, quando a análise foi estendida a densidades de CpG superiores a 1 kb, uma parte substancial (aproximadamente dois terços) das regiões com mais de 10 CpG ficou abaixo de 10 CpG/1 kb. Isto indica que regiões com alta densidade de CpG tendem a apresentar uma diminuição na densidade ao longo de trechos de DNA mais longos.

Além disso, uma comparação entre MeDIP-Seq e RRBS métodos, ambos aplicados às mesmas amostras de conjuntos de dados de truta arco-íris, mas realizados por diferentes laboratórios, revelaram preconceitos distintos associados a cada abordagem. O MeDIP-Seq exibiu uma preferência por regiões de menor densidade de CpG, enquanto o RRBS mostrou uma propensão para regiões de maior densidade de CpG.

O RRBS prova ser particularmente adequado para investigar alterações na metilação do DNA em regiões ricas em CpG, como promotores e ilhas de CpG, enquanto o MeDIP-Seq é mais adequado para perfilar padrões de metilação em regiões de baixa densidade de CpG em todo o genoma. A disponibilidade de conjuntos de dados tanto de MeDIP-Seq como de RRBS para as mesmas amostras no estudo do truta steelhead ofereceu uma oportunidade valiosa para validação cruzada e destacou as forças e limitações de cada método.

• Análise WGBS

A análise de sequenciação de bisulfito de genoma completo (WGBS) Dados de várias espécies forneceram informações valiosas sobre a distribuição da densidade de CpG nos conjuntos de dados adquiridos. Os resultados revelam que a densidade de CpG no conjunto de dados WGBS está dentro de uma faixa comparável à observada no conjunto de dados de sequenciação bisulfito de representação reduzida (RRBS). No entanto, foram identificadas diferenças notáveis nas distribuições de densidade de CpG entre estas duas análises.

Especificamente, os conjuntos de dados WGBS exibem variações subtis, mostrando uma propensão para densidades de CpG mais elevadas, particularmente na faixa de 2-5 CpG/100bp e densidades de CpG que excedem 10 CpG/100bp. Isso sugere que os dados WGBS estão inclinados a direcionar e capturar alterações na metilação do DNA em regiões enriquecidas com uma maior densidade de locais de CpG.

Notavelmente, além das galinhas, as regiões com 1 CpG/100bp foram as menos detectadas nos conjuntos de dados de WGBS, implicando que o WGBS tem menos probabilidade de identificar regiões diferencialmente metiladas (DMRs) em áreas com densidades de CpG extremamente baixas.

Referência:

1. Beck, Daniel, Millissia Ben Maamar, e Michael K. Skinner. "Comparações de métodos de análise de densidade de CpG em todo o genoma e metilação de DNA (MeDIP, RRBS e WGBS)." Epigenética 17.5 (2022): 518-530.