Identificação de DMC, DMR e DMG na Análise de Metilação do DNA

A metilação do DNA, uma modificação química do DNA, pode influenciar a expressão genética sem alterar a sequência do DNA. Envolve a ligação covalente de um grupo metilo à posição 5 do carbono da citosina do dinucleótido CpG genómico através da ação da metiltransferase do DNA. Este processo tem demonstrado induzir alterações na estrutura da cromatina, conformação do DNA, estabilidade do DNA e interações entre DNA e proteínas, regulando assim a expressão génica.

Para a mineração de dados, a análise de metilação do DNA geralmente segue três etapas:

• Análise de alterações de metilação em todo o genomaIsto inclui a avaliação das alterações nos níveis médios de metilação, alterações na distribuição dos níveis de metilação, a realização de análises de redução de dimensionalidade, análises de cluster, análises de correlação e outras técnicas relacionadas.
• Análise do nível de diferença de metilação: Este passo envolve a identificação de genes diferenciais específicos através da identificação de DMC/DMR/DMG (CpGs/regiões/genes diferentemente metilados), localizando DMC/DMR em elementos genómicos, realizando uma análise de ligação de TF (fatores de transcrição) em DMC/DMR, implementando estratégias de análise para dados de metilação em séries temporais e realizando uma análise funcional de DMG.
• Genómica de metilação & análise de associação em transcriptómicaNesta fase, é avaliada a associação geral dos genes Meta, bem como a associação correspondente entre DMG (genes diferencialmente metilados) e DEG (genes diferencialmente expressos), e a criação de associações em rede.

Então, como fazer a análise do nível de metilação diferencial para identificar DMC, DMR e DMG em genes diferenciais específicos?

Análise de Locais/Regiões de Metilação Diferencial - Análise de DMC/DMR

Identificação DMC/DMR

Neste passo, o objetivo principal é identificar locais específicos (DMCs) e regiões (DMRs) no genoma onde ocorre metilação diferencial entre diferentes grupos experimentais. Isso pode envolver a comparação dos níveis de metilação entre amostras de doença e de controlo, amostras tratadas e não tratadas, ou diferentes pontos temporais em um experimento de curso temporal.

• Identificação de DMC (Sites de Metilação Diferencial): Testes estatísticos são aplicados a sites de CpG individuais para determinar se existem diferenças significativas nos níveis de metilação entre grupos experimentais. Os sites de CpG que mostram diferenças estatisticamente significativas são rotulados como DMCs.
• Identificação de DMR (Região Diferencialmente Metilada): DMCs que estão em estreita proximidade uns dos outros são agrupados em DMRs. Vários algoritmos e métodos estatísticos são utilizados para identificar regiões do genoma com alterações coordenadas na metilação.

Análise de Ligação de Fatores de Transcrição DMC/DMR (Motivo de Ligação de TF)

O foco nesta etapa é investigar se os DMCs/DMRs se sobrepõem a locais de ligação de fatores de transcrição (TF) conhecidos, particularmente em regiões regulatórias como promotores e potenciadores.

Análise do Motivo de Ligação de TF: Ferramentas e bases de dados de bioinformática são utilizadas para prever motivos de ligação de TFs em DMCs/DMRs. Esta informação pode fornecer insights sobre os potenciais fatores reguladores envolvidos na metilação diferencial.

(3) Estratégia de Análise de Dados de Metilação Temporal (Curso Temporal)

Se o desenho experimental incluir múltiplos pontos no tempo ou dados de curso temporal, a estratégia de análise é adaptada para comparar as alterações na metilação ao longo do tempo.

• Comparação Entre Pontos de Tempo Vizinhos: As diferenças nos perfis de metilação entre pontos de tempo adjacentes são avaliadas para identificar mudanças dinâmicas.
• Triagem Direta de DMCs e DMRs Relacionados com a Evolução Temporal: DMCs/DMRs específicos que mostram alterações consistentes ao longo dos pontos temporais são identificados.
• Modelo Linear/Modelo Linear Híbrido: Modelos estatísticos, como a regressão linear ou modelos lineares híbridos, são utilizados para considerar fatores de confusão (por exemplo, género) e avaliar mudanças relacionadas com o tempo na metilação.
• Análise de Padrões de Co-Metilação (Triagem de Grupos Específicos de Estágio): Métodos de agrupamento, como WGCNA, MEGENA e mfuzz, podem ser aplicados para identificar grupos de locais ou regiões co-metilados que exibem padrões semelhantes em diferentes estágios ou pontos no tempo.

Distribuição DMC/DMR em Elementos Genéticos

Nesta fase, realizamos uma investigação aprofundada sobre a localização genómica dos CpGs Diferencialmente Metilados (DMCs) e das Regiões Diferencialmente Metiladas (DMRs), com foco na sua distribuição dentro de elementos genéticos distintos.

• Análise de Elementos Transponíveis (ET): Os elementos transponíveis representam entidades genómicas capazes de se mobilizar dentro do genoma, com o potencial de exercer efeitos significativos na estabilidade genómica. A análise dos seus padrões de metilação oferece informações valiosas sobre a complexa regulação do genoma.
• Análise de Promotores: Esclarecer as alterações na metilação dentro dos promotores genéticos tem implicações fundamentais para a expressão génica, uma vez que pode influenciar a ligação de fatores de transcrição cruciais e da RNA polimerase.
• Análise do Corpo do Gene: A investigação dos padrões de metilação dentro dos corpos dos genes também é relevante para a expressão génica e os processos de splicing alternativo, influenciando ainda mais o resultado funcional dos genes.

A análise DMC/DMR envolve uma abordagem multifacetada que abrange metodologias computacionais, análise estatística rigorosa e a integração de diversas informações genómicas. Esta metodologia abrangente permite-nos descobrir padrões distintivos de alterações na metilação do DNA e elucidar as suas potenciais consequências funcionais. Em última análise, os resultados desta investigação fornecem insights inestimáveis sobre os intrincados mecanismos epigenéticos que governam a expressão génica, lançando assim luz sobre os fundamentos moleculares subjacentes a diversos processos biológicos e condições patológicas.

Análise Funcional de Genes Diferencialmente Metilados (DMGs)

A análise funcional de genes diferencialmente metilados (DMGs) é um passo crucial para entender os processos biológicos e as vias influenciadas por alterações na metilação do DNA. Os DMGs são genes que possuem pelo menos uma região diferencialmente metilada (DMR) anotada ao seu promotor ou corpo do gene. As DMRs na região do promotor têm o potencial de influenciar a transcrição do gene, enquanto as DMRs na região do corpo do gene frequentemente mostram uma correlação positiva com os níveis de expressão gênica. Analisar esses DMGs pode fornecer insights valiosos sobre as funções regulatórias da metilação do DNA.

(1) Categorização de DMGs

• Hyper-DMG: Genes que mostram níveis aumentados de metilação de DNA nas DMRs em comparação com o grupo de controlo. O aumento da metilação na região do promotor pode levar à inibição da transcrição.
• Hypo-DMG: Genes que apresentam níveis de metilação de DNA diminuídos nas DMRs em comparação com o grupo de controlo. A diminuição da metilação na região do corpo do gene pode estar associada ao aumento da expressão génica.

(2) Promotor-DMG e Genebody-DMG

• Promotor-DMG: Genes com regiões diferencialmente metiladas nas suas regiões promotoras. Estes genes podem sofrer alterações na regulação transcricional devido a mudanças na metilação do promotor.
• Genebody-DMG: Genes com regiões diferencialmente metiladas nas suas regiões do corpo do gene. Alterações na metilação no corpo do gene podem impactar a expressão gênica e o splicing alternativo.

(3) Análise de Enriquecimento Funcional

A Análise de Enriquecimento Funcional é uma abordagem investigativa vital que proporciona insights valiosos sobre o intrincado panorama das alterações na metilação do DNA e as suas ramificações em vários contextos biológicos. Esta análise envolve a exame da Ontologia Genética (GO) para discernir processos biológicos, funções moleculares e componentes celulares enriquecidos associados a Genes Diferencialmente Metilados (DMGs). Além disso, a investigação estende-se à análise de vias KEGG, que elucida o significativo enriquecimento de DMGs dentro de várias vias biológicas, iluminando assim o seu contexto funcional.

Além disso, a exploração da análise de caminhos do Reactome revela as vias moleculares específicas e as cascatas de sinalização nas quais os DMGs estão implicados. Ao integrar a análise da Doença DisGeNET e a Ontologia da Doença, os investigadores obtêm informações valiosas sobre a associação dos DMGs com doenças específicas e termos relacionados com doenças, fornecendo pistas cruciais sobre o papel potencial da metilação do DNA na patogénese da doença.

Sem dúvida, a análise funcional aprofundada dos DMGs permite que os investigadores promovam uma compreensão abrangente da intrincada interação entre as alterações na metilação do DNA e diversos processos biológicos. Consequentemente, este esforço facilita a formulação de hipóteses sobre os papéis regulatórios da metilação do DNA e as suas implicações em vários contextos fisiológicos e patológicos. Em última análise, a combinação de dados epigenéticos e de genómica funcional contribui significativamente para uma compreensão profunda da regulação genética e da complexidade subjacente aos processos celulares.

Deteção de Nível de Metilação Diferencial

O fluxo de trabalho para a deteção e análise de níveis de metilação diferencial descrito acima envolve várias etapas-chave, incluindo a deteção de DMRs, anotação de DMRs, análise funcional de genes diferencialmente metilados (DMGs) e visualização de DMRs. Esta abordagem abrangente permite que os investigadores identifiquem regiões com alterações significativas na metilação do DNA, compreendam as suas potenciais implicações funcionais e visualizem os resultados para uma melhor interpretação.

Deteção de Regiões de Metilação Diferencial (DMR)

Os DMRs são detetados utilizando o software metilene, que emprega um algoritmo de segmentação binária combinado com testes estatísticos duplos (teste MWU e teste KS 2D).

Os seguintes critérios são utilizados para definir DMRs:

• Profundidade de sequenciação de cada sítio CpG >= 5x.
• Metilação diferencial de locais CpG >= 0,2 (indicando uma alteração substancial nos níveis de metilação).
• Número de sítios CpG diferencialmente metilados na região >= 5 (assegurando cobertura suficiente).
• Distância entre sítios CpG diferencialmente metilados adjacentes <= 300bp.
• Valor p do teste MWU < 0,05 (indicando significância estatística).

Os locais CpG que atendem a esses critérios são utilizados para definir as regiões diferencialmente metiladas.

Anotação de Região de Metilação Diferencial (DMR)

Os DMRs identificados estão anotados às regiões do corpo do gene e do promotor, respetivamente. Este passo ajuda a ligar os DMRs a genes específicos e a compreender as suas potenciais implicações regulatórias na expressão génica.

(3) Análise Funcional de Genes Diferencialmente Metilados (DMGs)

A análise de enriquecimento de GO (Gene Ontology) e KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) é realizada para estudar as funções dos DMGs. O enriquecimento dos DMGs em termos de GO e vias de KEGG é analisado utilizando um teste de distribuição hipergeométrica. Esta análise fornece informações sobre os processos biológicos e vias influenciados pela metilação diferencial do DNA.

(4) Visualização de Regiões Diferencialmente Metiladas (DMRs)

Devido ao grande número de DMRs, os 20 principais DMRs com valor Q (valor p ajustado) são selecionados para visualização.

Ao seguir este fluxo de trabalho, os investigadores podem identificar e caracterizar regiões diferencialmente metiladas, obter informações sobre as potenciais consequências funcionais das alterações na metilação do DNA e visualizar eficazmente os resultados para ajudar na interpretação dos dados e na geração de hipóteses.