Sequenciação com Bisulfito: Introdução, Características, Fluxo de Trabalho e Aplicações

Metilação do DNA

A metilação do DNA, um processo biológico fundamental, envolve a adição de um grupo metilo a bases específicas dentro da sequência de DNA através de ligações covalentes facilitadas pela metiltransferase do DNA (DNMT).

Esta modificação química é uma forma fundamental de regulação epigenética, preservando a sequência de DNA enquanto influencia a atividade genética. Exercita efeitos profundos em vários fenómenos biológicos, incluindo a expressão génica, o desenvolvimento embrionário, a proliferação celular, a diferenciação, a manutenção da estabilidade do genoma e a defesa contra invasões de DNA exógeno.

A metilação do DNA ocorre em diferentes posições nas bases do DNA, como a posição C-5 da citosina, a posição N-6 da adenina e a posição N-7 da guanina, catalisada por várias enzimas de metilação do DNA. Notavelmente, a metilação do quinto átomo de carbono da citosina em locais CpG (locais citosina-fosfato-guanina) é amplamente investigada, resultando em 5-metilcitosina (5-mC).

5-mC, o produto resultante, é ubíquo nos genomas de plantas, animais e outros organismos eucariotos, representando uma das formas de modificação por metilação do DNA mais extensivamente estudadas.

Diferentes métodos de análise de metilação de DNA baseados em NGS. (Jeong et al., 2016)

O que é a Sequenciação com Bisulfito (BS-seq)?

Sequenciação por bisulfito, frequentemente abreviado como BS-seq, é um método poderoso utilizado para detectar padrões de metilação do DNA com resolução de base única. Ao tratar o DNA com bisulfito, as citosinas não metiladas são convertidas em uracilo, enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. Esta conversão diferencial permite que os investigadores distingam entre citosinas metiladas e não metiladas ao analisar a sequência de DNA. Esta técnica é crucial para compreender a regulação epigenética e o seu papel em vários processos biológicos, incluindo desenvolvimento, doença e expressão génica.

O princípio do genoma completo BS-seq envolve o tratamento de DNA genómico com bisulfito de sódio, que converte todas as citosinas não metiladas em uracilo, enquanto deixa as citosinas metiladas inalteradas. Após o tratamento com bisulfito, são desenhados primers para amplificar regiões de interesse, tipicamente ilhas CpG, através de PCR. Os produtos de PCR resultantes são então purificados e clonados utilizando clonagem TA. Clones positivos são selecionados e submetidos a sequenciação, permitindo a determinação do estado de metilação em cada local CpG. Finalmente, os dados sequenciados são alinhados com a sequência genómica original para determinar o número e a localização dos locais metilados, bem como para analisar o nível global de metilação.

Sequenciação de bisulfito oxidativa (OxBS-seq) e sequenciação de bisulfito padrão (BS-seq). (Rauch et al., 2023)

O Fluxo de Trabalho da BS-seq

• Teste de Qualidade de Amostras de DNA

As amostras de ADN passam por uma avaliação inicial de qualidade para garantir a sua adequação para sequenciação.

• Construção de Biblioteca

O DNA genómico é fragmentado em fragmentos de 100-300 bp através de sonicação.

As extremidades do DNA são reparadas, uma base A é adicionada na extremidade 3' e os adaptadores de sequenciação são ligados.

O tratamento com bisulfito é aplicado para converter citosinas não metiladas em uracilo.

Os passos de dessalinização e purificação em gel são realizados para selecionar os tamanhos de fragmentos da biblioteca apropriados.

A amplificação por PCR é realizada para enriquecer os fragmentos da biblioteca, seguida de outra ronda de seleção por tamanho.

Os controlos de qualidade são realizados nas bibliotecas construídas.

• Sequenciação

As bibliotecas que passam no controlo de qualidade são sujeitas a sequenciação de alto rendimento.

• Análise de Dados

Os resultados de sequenciação estão alinhados ao genoma de referência.

Sequências únicas são extraídas para análise subsequente.

A filtragem inicial de dados é realizada para remover leituras de baixa qualidade.

• Validação de Dados

A quantidade de dados utilizáveis é avaliada para garantir a conformidade com os requisitos do projeto.

A comparação dos dados disponíveis com o genoma de referência é realizada, resultando em resultados de comparação.

• Análise de Metilação

Dados de comparação verificados quanto à qualidade são utilizados para derivar informações de metilação em todo o genoma.

A análise e processamento de informações são realizados para gerar resultados de análise padrão e personalizados.

Interpretação dos Resultados: Os padrões de metilação e as variações são interpretados no contexto da sua significância biológica e das potenciais implicações para as amostras estudadas.

Vantagens da sequenciação BS (Bisulfito)

• Fornece uma cobertura abrangente da metilação CpG e não CpG em todo o genoma com resolução de base única.
• Permite a análise de padrões de metilação em diversas regiões genómicas, incluindo sequências densas, menos densas e repetitivas.

Desafios da sequenciação de bisulfito (BS-seq)

• O tratamento com bisulfito converte citosinas não metiladas em timidinas, reduzindo a complexidade da sequência e tornando difícil gerar comparações precisas.
• Ocorrência potencial de posições de nucleotídeos (NPs) onde a conversão de citosina em timidina é incompleta durante o tratamento com bisulfito.
• Incapaz de distinguir entre 5-metilcitosina (5mC) e 5-hidroximetilcitosina (5hmC), levando a ambiguidade na determinação do estado de metilação.

À medida que a tecnologia avançou, surgiram numerosas variações de sequenciação por bisulfito (BS-seq) surgiram, cada uma com as suas próprias vantagens e aplicações.

• oxBS-seq (Sequenciação de Bisulfito Oxidado): Como mencionado anteriormente, a oxBS-seq envolve a oxidação de 5-hidroximetilcitosina (5hmC) a 5-formilcitosina (5fC) antes do tratamento com bisulfito, permitindo a deteção precisa de 5-metilcitosina (5mC).
• TAB-seq (Sequenciação de Bisulfito Assistida por Tet): Este método envolve o uso de enzimas Tet para oxidar 5mC a 5hmC ou formas oxidativas adicionais antes do tratamento com bisulfito, permitindo a discriminação entre diferentes modificações de citosina.
• CMS-seq (Sequenciação de Metilação de Cromatina): CMS-seq combina sequenciação com bisulfito e imunoprecipitação de cromatina (ChIP), permitindo a análise simultânea da metilação do DNA e das modificações de histonas.
• BSPP-seq (Sequenciação com Provas de Padlock de Bisulfito): Este método utiliza provas de padlock para capturar regiões-alvo de interesse antes do tratamento com bisulfito, permitindo a sequenciação de bisulfito direcionada com cobertura e sensibilidade aprimoradas.
• BS-PCR (Reacção em Cadeia da Polimerase com Bisulfito): Esta técnica envolve o tratamento com bisulfito seguido pela amplificação por PCR de regiões-alvo específicas, permitindo uma análise direcionada da metilação do DNA.
• BSAS (Sequenciação de Amplicões de Bisulfito): Semelhante ao BS-PCR, o BSAS envolve o tratamento com bisulfito e a amplificação por PCR de regiões-alvo específicas, mas normalmente utiliza sequenciação de nova geração para análise de alto rendimento.

Sequenciação de Bisulfito de Genoma Inteiro (WGBS)

Sequenciação de Bisulfito de Genoma Inteiro (WGBS) é uma técnica poderosa utilizada para a análise de metilação de DNA em todo o genoma. Fornece resolução de base única da metilação de DNA em todo o genoma.

No WGBS, o DNA genómico é tratado com bisulfito de sódio, que converte as citosinas não metiladas em uracilo, enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. Após o tratamento com bisulfito, utiliza-se sequenciação de alta capacidade (Next-Generation Sequencing - NGS) para sequenciar os fragmentos de DNA tratados. Ao comparar as leituras de sequenciação com um genoma de referência, os investigadores podem determinar o estado de metilação de citosinas individuais em todo o genoma.

WGBS tem sido amplamente utilizado em várias espécies, incluindo humanos, plantas, animais e organismos inferiores, para estudar padrões de metilação de DNA em todo o genoma. Fornece informações valiosas sobre o papel da metilação de DNA na regulação genética, desenvolvimento, doença e evolução.

Sequenciação de Bisulfito de Genoma Inteiro (WGBS) – CD Genomics

Sequenciação de Bisulfito com Representação Reduzida (RRBS)

Sequenciação de bisulfito com representação reduzida (RRBS) é um método que envolve o enriquecimento de fragmentos ricos em CCGG no DNA genómico através da digestão com enzimas de restrição. Subsequentemente, esses fragmentos enriquecidos, que tipicamente contêm regiões ricas em CpG do genoma, passam por sequenciação de metilação com resolução de base única através de tratamento com bisulfito e tecnologia de sequenciação de alto rendimento. Comparado com a Sequenciação de Bisulfito de Todo o Genoma (WGBS), RRBS é uma abordagem mais rentável, pois requer um volume de sequenciamento significativamente menor, ao mesmo tempo que fornece dados valiosos de sequenciamento de metilação. Isso torna o RRBS particularmente adequado para estudos clínicos em larga escala que envolvem análise de metilação em todo o genoma.

Em termos simplificados, o tratamento com bisulfito converte citosinas (C) não metiladas em uracilo (U), que são então lidas como timina (T) durante o sequenciamento. Ao comparar o número de leituras que são convertidas em timina com o número total de leituras que cobrem um local específico de citosina, os investigadores podem calcular a taxa de metilação nesse local. Esta técnica é inestimável para estudar vários processos biológicos, como o desenvolvimento embrionário, os mecanismos de envelhecimento, o desenvolvimento de doenças e a identificação de loci de marcadores epigenéticos relacionados com doenças.

Sequenciação de Bisulfito com Representação Reduzida – CD Genomics

Sequenciação de Bisulfito Oxidativa (oxBS-seq)

A importância da hidroximetilação (5hmC) no genoma dos mamíferos e as suas implicações em vários processos biológicos, como o desenvolvimento, o envelhecimento, as doenças neurodegenerativas e a tumorigenese. A hidroximetilação é, de facto, uma descoberta relativamente recente no campo da epigenética e tem atraído uma atenção significativa devido aos seus papéis emergentes e potenciais implicações.

Um dos principais desafios no estudo da hidroximetilação do DNA é distingui-la da metilação do DNA (5mC), particularmente utilizando métodos convencionais de sequenciação com bisulfito. Como mencionou, o tratamento com bisulfito converte tanto 5mC como 5hmC em produtos semelhantes, tornando difícil diferenciar entre as duas modificações.

Sequenciação por bisulfito oxidativooxBS-Seq) é uma técnica sofisticada que aborda este desafio. Ao oxidar quimicamente 5hmC para um produto intermédio diferente antes do tratamento com bisulfito, o oxBS-Seq permite a deteção específica de 5mC enquanto exclui os efeitos de 5hmC. Além disso, o oxBS-Seq pode ser combinado com outras abordagens de sequenciação para detectar simultaneamente tanto a metilação do DNA quanto a hidroximetilação com resolução de base única.

Este avanço na tecnologia melhorou significativamente a nossa capacidade de dissecção da complexa interação entre a metilação do DNA e a hidroximetilação, bem como os seus papéis em vários processos biológicos e doenças. oxBS-Seq tem um imenso potencial para aprofundar a nossa compreensão da regulação epigenética e das suas implicações para a saúde e a doença humanas.

BSAS (Sequenciação de Amplicões de Bisulfito)

A sequenciação de amplicões de bisulfito é uma abordagem direcionada para analisar padrões de metilação ou hidroximetilação do DNA em regiões genómicas específicas de interesse. Aqui está como a técnica normalmente funciona:

• Desenho de Primers: Primers de amplificação específicos para metilação são projetados para direcionar sequências de DNA específicas dentro do genoma. Essas sequências muitas vezes correspondem a regiões de interesse, como genes ou elementos regulatórios.
• Tratamento com Bisulfito: O DNA genómico é tratado com bisulfito, que converte citosinas não metiladas em uracilo (e posteriormente em timina durante a PCR), enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. No caso da análise de hidroximetilação, pode ser incluído um passo adicional de oxidação para converter a hidroximetilcitosina (5hmC) em um intermediário diferente antes do tratamento com bisulfito.
• Amplificação por PCR: O DNA tratado com bisulfito é então submetido a amplificação por PCR utilizando primers específicos para metilação. Esta etapa de amplificação visa seletivamente as regiões de interesse, resultando na geração de fragmentos de DNA correspondentes a essas regiões.
• Sequenciação: Os fragmentos de DNA amplificados são então submetidos a sequenciação em larga escala utilizando tecnologias de sequenciação de nova geração, como a sequenciação Illumina. Isso permite a deteção precisa do estado de metilação ou hidroximetilação das regiões gênicas alvo com resolução de uma única base.

Ao focar em regiões genómicas específicas de interesse, a sequenciação de amplicões de bisulfito fornece um método económico e eficiente para a análise direcionada da metilação ou hidroximetilação do DNA. Esta abordagem é particularmente útil ao estudar o estado de metilação de genes específicos ou elementos regulatórios associados a processos biológicos ou doenças particulares.

Sequenciação de Bisulfito Assistida por Tet

A sequenciação TAPS, ou Sequenciação de Bisulfito Assistida por Tet, é um método inovador para analisar padrões de metilação do DNA que oferece várias vantagens em relação às técnicas tradicionais de sequenciação por bisulfito.

Na sequenciação por bisulfito assistida por Tet, a conversão por bisulfito é substituída por uma abordagem química diferente que converte diretamente as citosinas metiladas (5mC) em timina (T) para sequenciação. Esta técnica utiliza uma combinação de reações enzimáticas e químicas para alcançar a conversão de citosina em timina.

Aqui está como funciona a sequenciação de bisulfito assistida por Tet:

• Oxidação de 5mC e 5hmC: Inicialmente, 5mC e 5hmC são oxidizados a 5caC (5-carboxicitosina) utilizando a oxidase TET1.
• Conversão para DHU: O 5caC oxidado é então convertido em dihidrouracilo (DHU) na presença do agente redutor borano de piridina (piridina). O DHU pode servir como um molde durante a amplificação por PCR.
• Amplificação por PCR: Durante a amplificação por PCR, a DNA polimerase reconhece o DHU como uracilo (U), levando à incorporação de adenina (A) em frente ao local do DHU. Como resultado, as citosinas na sequência original de DNA são efetivamente convertidas em timinas no produto final da PCR.

As vantagens da tecnologia TAPS incluem:

• Não destrutivo para o DNA: Ao contrário da conversão por bisulfito, o sequenciamento por bisulfito assistido por Tet não degrada o DNA, resultando em menos perda de DNA durante o processo.
• Melhoria da qualidade dos dados de sequenciação: A sequenciação por bisulfito assistida por Tet preserva o equilíbrio das bases da sequência de DNA, resultando em dados de sequenciação de maior qualidade com maior cobertura e complexidade.
• Custo-efetividade: A tecnologia de sequenciação por bisulfito assistida por Tet é geralmente mais custo-efetiva do que os métodos tradicionais de conversão por bisulfito.
• Além disso, a sequenciação de bisulfito assistida por Tet permite a retenção de fragmentos de ADN mais longos (até 10kb), o que é benéfico para aplicações posteriores, como a sequenciação tripla.

No geral, a sequenciação por bisulfito assistida por Tet oferece uma alternativa promissora à sequenciação por bisulfito para a análise de metilação do DNA, proporcionando uma melhor qualidade de dados, redução da perda de DNA e custo-efetividade.

OxBS-Seq, BS-Seq e TAB-Seq. (Schüler et al., 2012)

Sequenciação por Nanoporos

Sequenciação por nanoporo é uma tecnologia revolucionária que permite o sequenciamento direto e em tempo real de moléculas de DNA e RNA.

• Deteção por Nanoporos: A sequenciação por nanoporos envolve a passagem de uma molécula de DNA ou RNA através de um nanoporo biológico ou de estado sólido. À medida que a molécula passa pelo nanoporo, provoca interrupções na corrente elétrica que flui através do poro. Estas interrupções são características da sequência de nucleotídeos específica da molécula.
• Deteção de Sinais: As interrupções na corrente elétrica são detectadas e registadas como "ziguezagues" pelo dispositivo de sequenciação por nanoporo. Cada nucleótido que passa pelo poro produz um padrão de ziguezague distinto, permitindo a determinação da sequência.
• Detecção de Metilação: Além da sequência de nucleotídeos, a sequenciação por nanoporo também pode detetar modificações epigenéticas, como a metilação do DNA. A presença de bases metiladas altera as propriedades elétricas dos nucleotídeos, resultando em padrões de sinal únicos quando estes passam pelo nanoporo.
• Modelos de Aprendizagem Profunda: Algoritmos de aprendizagem profunda são utilizados para analisar os complexos padrões de sinal gerados pela sequenciação por nanoporo. Ao treinar estes modelos com padrões de metilação conhecidos, os investigadores podem desenvolver ferramentas que identificam e caracterizam com precisão as modificações de metilação em moléculas de DNA e RNA com base nos sinais da sequenciação por nanoporo.

No geral, a sequenciação por nanoporo, combinada com modelos de aprendizagem profunda, oferece uma abordagem poderosa e versátil para a deteção direta de sequências de DNA e RNA, bem como modificações epigenéticas como a metilação do DNA. Esta tecnologia tem aplicações abrangentes em genómica, epigenética e investigação biomédica.

Referências:

1. Rauch, Tibor A., e Gerd P. Pfeifer. "Métodos para analisar modificações de citosina no DNA em todo o genoma." Manual de Epigenética. Academic Press, 2023. 123-135.
2. Schüler, Peter, e Aubry K. Miller. "Sequenciamento da Sexta Base (5‐Hidroximetilcitosina): A Oxidação Seletiva de DNA Permite a Resolução de Pares de Bases." Angewandte Chemie Edição Internacional 51,43 (2012): 10704-10707.
3. Jeong H.M., et al. Eficiência da imunoprecipitação de DNA metilado seguida de sequenciação por bisulfito para análise de metilação de DNA em todo o genoma. Epigenomics. 2016, 8(8):1061-77.