Protocolo de Sequenciação de Bisulfito de Genoma Inteiro (WGBS)

Tratamento com Bisulfito

1. Prepare o Reagente adicionando 900 μL de água, 300 μL de M-Bufador de Diluição e 50 μL de M-Bufador de Dissolução. Dissolva completamente o pó misturando à temperatura ambiente durante pelo menos 10 min. Prepare antes de usar.
2. Misture 130 μL de reagente de conversão CT, 100 ng de DNA e 1 ng de DNA lambda não metilado num tubo de PCR, e ajuste o volume total para 150 μL com água.
3. Incube os tubos a 98°C durante 10 min e a 64°C durante 150 min.
4. Carregue a amostra na coluna Zymo Spin com 600 μL de bufador M-Binding.
5. Misture a amostra e o bufador M-Binding invertendo a coluna Zymo Spin.
6. Centrifugue a 10.000 ×g durante 1 min e descarte o fluxo.
7. Adicione 200 μL de bufador M-Desulfonação à coluna clara e incube à temperatura ambiente durante 15 min.
8. Transfira a coluna para um novo tubo.
9. Adicione 20–40 μL de bufador M-Eluição diretamente à coluna.
10. Centrifugue durante 30 s à velocidade máxima para eluir o DNA.
11. Use 1 μL do eluído para medir a quantidade de DNA.

Primagem Aleatória

1. Misture o DNA tratado com bisulfito, 5 μL de 10× NEBuffer 2, 4 μL de solução de dNTP e 1 μL de 100 μM PEA2 N4 num tubo de PCR, e ajuste o volume total para 50 μL com água.
2. Incube a 95°C durante 3 min e a 4°C durante 5 min.
3. Adicione 1 μL de fragmento Klenow (3'–5' exo-) à reação.
4. Incube a mistura a 4°C durante 15 min, e aumente a temperatura a uma taxa de +1°C/min até 37°C. Após manter a reação a 37°C durante 30 min, inative a enzima aquecendo a 70°C durante 10 min.
5. Adicione 50 μL de AMPure XP à reação, mantenha o tubo à temperatura ambiente durante 5 min, coloque o tubo num suporte magnético para coletar as esferas e remova o sobrenadante.
6. Adicione 200 μL de solução de corte de 300 bp, ressuspenda as esferas, coloque o tubo num suporte magnético e remova o sobrenadante.
7. Repita o passo anterior uma vez.
8. Após enxaguar as esferas com 200 μL de etanol 70% (v/v), elua o DNA com 12 μL de Tris–HCl 10 mM, pH 8.5.
9. Meça a quantidade de DNA.

Ligação TACS

1. Misture 10 μL de bufador de reação TACS 2.5×, 11 μL do DNA purificado no passo anterior, 1 μL de 30 μM PA-anti-PEA1 P e 1 μL de 10 mM ATP num tubo de PCR.
2. Incube a 95°C durante 5 min e a 4°C durante 5 min.
3. Adicione 1 μL de TdT a 15 U/μL e 1 μL de CircLigase II a 100 U/μL à reação.
4. Incube a 37°C durante 30 min, a 65°C durante 120 min e a 95°C durante 5 min.

Extensão de Primer (1)

1. Adicione 5 μL de bufador universal Gene Taq 10×, 4 μL de dNTPs a 2.5 mM, 1 μL de primer de indexação, 1 μL de Hot Start GeneTaq a 2.5 U/μL e 14 μL de água à reação após a ligação TACS.
2. Incube a 95°C durante 3 min, a 45°C durante 3 min e a 72°C durante 30 min.
3. Adicione 20 μL de Buffer B2 e 5 μL de proteinase K a 20 mg/mL à reação.
4. Incube a 50°C durante 15 min.
5. Adicione 50 μL de AMPure XP e, em seguida, incube durante 5 min à temperatura ambiente.
6. Colete as esferas e remova o sobrenadante.
7. Lave as esferas com 200 μL de solução de corte.
8. Repita o passo anterior uma vez.
9. Enxágue as esferas com 200 μL de etanol 70% (v/v).
10. Remova completamente a solução residual.
11. Adicione 40 μL de Tris-acetato 10 mM para ressuspender as esferas, coloque o tubo no suporte magnético para separar as esferas e transfira o sobrenadante para um novo tubo de PCR.
12. Meça a concentração de DNA.

Extensão de Primer (2)

1. Adicione 5 μL de bufador universal GeneTaq 10×, 4 μL de dNTPs a 2.5 mM, 1 μL de Primer-3 a 60 μM e 1 μL de Hot Start GeneTaq a 5 U/μL a 39 μL do DNA purificado no passo anterior.
2. Incube a 94°C durante 3 min, a 45°C durante 5 min e a 72°C durante 30 min.
3. Adicione 50 μL de AMPure XP e incube à temperatura ambiente durante 5 min.
4. Colete as esferas colocando o tubo num suporte magnético.
5. Lave as esferas com 200 μL de solução de corte.
6. Repita o passo uma vez.
7. Enxágue as esferas com 200 μL de etanol 70% (v/v).
8. Remova completamente a solução residual.
9. Adicione 26 μL de Tris-acetato 10 mM para ressuspender as esferas, coloque o tubo no suporte magnético para separar as esferas e transfira o sobrenadante para um novo tubo de PCR.
10. Pegue 1 μL do DNA purificado para medir a concentração.

QC da Biblioteca

1. Descongele o conteúdo do kit de Quantificação de Biblioteca à temperatura ambiente.
2. Prepare uma solução de mistura mestre misturando 10 μL/poço de Terra PCR Direct TB Green Premix (2×), 4 μL/poço de Mistura de Primer 5×, 0.4 μL/poço de Corante de Referência ROX 50× e 3.6 μL/poço de água para preparar uma solução de mistura mestre. Multiplique o volume de cada reagente pelo número de poços.
4. Dispense 18 μL da mistura mestre em cada tubo de PCR.
5. Dilua as bibliotecas com Tris–HCl 10 mM (pH 0.0) em taxas de diluição apropriadas.
6. Adicione 2 μL de templates, ou seja, padrão, controle não template ou bibliotecas diluídas, a um tubo de PCR contendo a mistura mestre.
7. Prepare a máquina de PCR em tempo real.
8. Realize a amplificação de PCR com o seguinte programa: 95°C durante 1 min; 35 ciclos de incubação em três etapas a 95°C durante 10 s, 60°C durante 15 s e 68°C durante 45 s.
9. Prepare um dispositivo de eletroforese.
10. Misture 1 μL de DNA amplificado por PCR com 10 μL de corante de carregamento desnaturante, incube a 70°C durante 5 min e carregue 5 μL da amostra em um gel de 6% Novex TBE-Urea.
11. Execute a eletroforese a 300 V.
12. Mancha o gel com corante de ácido nucleico SYBR Gold e tire uma fotografia.

Sequenciamento

1. Misture as bibliotecas adequadamente.
2. Ajuste a concentração.
3. Execute o sequenciador.

Referência:

1. Miura F, Ito T. Marcação de Adaptador Pós-bisulfito com uma Técnica de Ligação de DNA de Cadeia Simples Altamente Eficiente[M]//Redes Regulatórias de Fatores de Transcrição. Humana, Nova Iorque, NY, 2023: 45-57.