Uma Visão Geral do hMeDIP-Seq, Introdução, Principais Características e Aplicações

Para estudar as modificações de 5hmC, hMeDIP-Seq é utilizado. É uma pequena alteração de MeDIP-seq, que se concentra no procedimento original de MeDIP. Embora esta técnica seja teoricamente quase idêntica ao MeDIP-seq, devido ao conhecimento biológico consideravelmente distinto que oferece, é considerada um procedimento diferente. Ambas as alterações de 5mC e 5hmC devem ser avaliadas para uma compreensão detalhada das mudanças epigenéticas.

Através da imunoprecipitação, o DNA metilado é separado do DNA genómico. Anticorpos anti-5hmC são subcultivados e instigados com gDNA fragmentado, precedidos pela purificação do DNA e preparação de uma biblioteca para sequenciação. A sequenciação profunda oferece uma cobertura mais alta do genoma, mostrando a maioria do DNA hidroximetilado que é imunoprecipitado.

Vantagens e Desvantagens do hMeDIP-seq

As vantagens do hMeDIP-seq são as seguintes:

• Em áreas de repetição espessas e menos espessas, 5hmC está coberto.
• A seleção baseada em anticorpos, devido à especificidade dos anticorpos, é autónoma da sequência e não aumenta 5mC.

Por outro lado, as suas desvantagens incluem:

• Em comparação com a resolução de base única com outras técnicas, a resolução de pares de bases é inferior (~150 pb).
• Para prevenir interações não específicas, a especificidade e a seletividade dos anticorpos devem ser avaliadas.
• Tendencioso em relação a áreas que estão hipermetiladas.

Aplicações e Pesquisa de hMeDIP-Seq

A metilação do DNA na posição 5 da citosina (5mC) é uma alteração epigenética essencial que desempenha um papel vital na formação de mamíferos e na diferenciação celular. Pesquisas mostraram que a família de proteínas de translocação dez-onze (TET) pode remover esta modificação aparentemente estável através da oxidação. 5mC-5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formilcitosina (5fC) e 5-carboxilcitosina (5caC) são oxidadas pelas proteínas TET (5caC). O 5hmC é o componente mais abundante in vivo entre os três derivados oxidativos de 5mC e pode ser identificado em quase todos os tecidos e células mamíferas. O 5hmC é agora considerado uma alteração epigenética, em relação a ser um dos estados intermédios da desmetilação do DNA.

Figura 1. Uma ilustração do ciclo de metilação da citosina. (Ecsedi, 2018)

O mapeamento do 5mC e 5hmC em todo o genoma revela as áreas genómicas dessas alterações, o que é crucial para que os seus mecanismos sejam elucidados. Para caracterizar a alocação do 5hmC em todo o genoma em tecidos cerebrais e células estaminais embrionárias, várias populações têm utilizado métodos de captura por afinidade específicos para 5hmC, acompanhados por sequenciação de próxima geração (NGS) ou arrays de tiling. Mesmo assim, continua a ser difícil empregar informações do hidroximetiloma de DNA obtidas por hMeDIP-seq padrão para realizar uma avaliação comparativa direta em todo o genoma entre espécimes com altos e baixos níveis de 5hmC devido a algumas restrições inerentes ao procedimento padrão de hMeDIP-seq. Por exemplo, o procedimento padrão atual de NGS da Illumina assegura o carregamento do mesmo número de bibliotecas de DNA para a geração de clusters distintos e espécimes de sequenciação, o que anula as distinções do produto hMeDIP entre diferentes espécimes (especialmente para aqueles com abundância diferencial de 5hmC). Relativamente, as várias etapas do procedimento padrão de hMeDIP-seq podem aumentar a variância experimental entre os espécimes, incluindo hMeDIP, construção de bibliotecas, hibridização de clusters e sequenciação. Técnicas computacionais elegantes foram estabelecidas por muitos laboratórios para estabilizar ou modificar os dados do metiloma de DNA produzidos a partir de vários espécimes. Mesmo assim, o preconceito induzido pelas restrições intrínsecas dos métodos padrão de MeDIP-seq ou hMeDIP-seq ainda não foi superado. Para superar esses problemas técnicos, a variação dramática dos níveis de 5hmC entre tecidos e células separados ou durante a diferenciação celular e o desenvolvimento embrionário requer estratégias e técnicas inovadoras.

Os hidroximetilomas de DNA de células-tronco embrionárias de rato (ESCs) e células progenitoras neurais extraídas de ESCs foram identificados e avaliados utilizando hMeDIP-seq num estudo recente. Os cientistas conseguiram identificar diferentes áreas hidroximetiladas (DHMRs) entre ESCs e NPCs e descobriram uma ligação complexa entre a modificação da hidroximetilação do DNA e as alterações na expressão génica durante o envolvimento da linhagem neural das ESCs.

Referências:

1. Ecsedi S, Rodríguez-Aguilera JR, Hernandez-Vargas H. 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), ou como identificar a sua célula favorita. Epigenomas. 2018, 2(1):3.
2. Feldmann A, Ivanek R, Murr R, et al. A ocupação de fatores de transcrição pode mediar a rotatividade ativa da metilação do DNA em regiões regulatórias. PLoS Genética. 2013, 9(12).
3. Tan L, Xiong L, Xu W, et al. Comparação em todo o genoma da hidroximetilação de DNA em células-tronco embrionárias de rato e células progenitoras neurais por um novo método comparativo de hMeDIP-seq. Pesquisa em ácidos nucleicos2013, 41(7).
4. Stroud H, Feng S, Kinney SM, et al.5-Hidroximetilcitosina está associada a potenciadores e corpos de genes em células estaminais embrionárias humanas. Biologia do genoma2011,12(6).