Uma Introdução ao Sequenciamento de Bisulfito de Representação Reduzida (RRBS)

O que é a metilação do DNA?

A metilação do DNA refere-se à adição de um grupo metilo (CH3) à cadeia de DNA, que é catalisada pelas metiltransferases de DNA (DNMTs). O DNA contém quatro tipos de bases nitrogenadas, nomeadamente citosina, guanina, timina e adenina (Figura 1A). Os investigadores descobriram que a citosina e a adenina podem ser metiladas. A metilação da citosina ocorre frequentemente na posição 5 do carbono da citosina (5-metilcitosina ou 5mC), que é encontrada exclusivamente em locais simétricos CG na dupla hélice de DNA em todo o genoma, nomeadamente na ilha CpG (Figura 2B). A metilação da citosina é generalizada tanto em eucariotos como em procariotos (Cloney, 2016; Cooper, 1983). A metilação da adenina ocorre na posição 6 do nitrogénio da adenina (N6-metiladenina ou N6mA). A metilação da adenina foi observada no DNA de bactérias, plantas e mamíferos (Ratel). et al.., 2006; Wu et al.., 2016), mas recebeu consideravelmente menos atenção (Figura 2B).

Figura 1. (A) Bases nitrogenadas encontradas no DNA e RNA. (B) A metilação da citosina e da adenina.

A metilação do DNA é uma das modificações epigenéticas mais importantes que está correlacionada com a repressão génica (Figura 2) e é conhecida por desempenhar um papel essencial no desenvolvimento embrionário, manutenção da pluripotência, impressão genética e inativação do cromossoma X através da regulação da transcrição, estrutura da cromatina e estabilidade dos cromossomas (Robertson, 2005). A metilação do DNA também pode afetar a saúde, resultando em cancro, doenças autoimunes, distúrbios neurológicos ou outras doenças. Em muitos processos patológicos, as ilhas CpG dos promotores génicos adquirem hipermetilação anormal, o que resulta em silenciamento transcricional que pode ser herdado pelas células filhas após a divisão celular (Wang e Lei, 2018). Alterações nos padrões de metilação do DNA têm sido reconhecidas como um componente importante do desenvolvimento do cancro (Figura 3).

Figura 2. A expressão génica pode ser regulada antes do início da transcrição pela modificação química do DNA ou das proteínas histonas associadas (metilação do DNA e acetilação de histonas) (Mukherjee) et al.., 2015).

Figura 3. Metilação do DNA e cancro. TSG: gene supressor de tumor. (Robertson, 2005)

Deteção de Metilação de DNA e RRBS

Compreender o papel da metilação do DNA no desenvolvimento e na doença requer conhecimento da distribuição dessas modificações no genoma (Harris) et al.., 2010). Medir a quantidade total de 5mC ou 5hmC (5-hidroximetilcitosina) permite que os investigadores obtenham uma visão profunda de processos biológicos e identifiquem biomarcadores para doenças. A deteção de padrões de metilação do DNA é uma área de investigação em rápida evolução e vários métodos estão disponíveis para a avaliação da metilação do DNA, sendo o tratamento com bisulfito um procedimento central para a maioria. Um algoritmo simples para escolher um método adequado para a análise da metilação do DNA é ilustrado na Figura 4 (Kurdyukov e Bullock, 2016).

Figura 4. Algoritmo para escolher um método adequado para a análise de metilação de DNA. Adaptado de (Kurdyukov e Bullock, 2016)

A sequenciação com bisulfito é a utilização do tratamento com bisulfito do DNA para determinar o seu padrão de metilação. et al.., 1992). O tratamento com bisulfito do DNA medeia a desaminação da citosina em uracilo, e estes resíduos convertidos serão lidos como timina, conforme determinado pela amplificação por PCR e análise de sequenciamento subsequente (Figura 5).

Figura 5. Medição da metilação do DNA por sequenciação com bisulfito (Imagem da Illumina).

Sequenciação de bisulfito de genoma completo (WGBS) é o método mais abrangente de análise de metilação do DNA e agora é considerado o método "padrão ouro" em estudos de metilação do DNA. As únicas limitações são o custo e as dificuldades na análise de dados de NGS. Sequenciação de bisulfito com representação reduzida (RRBS), que combina enzimas de restrição e sequenciação com bisulfito para enriquecer áreas do genoma com um alto conteúdo de CpG, é uma técnica eficiente e de alto rendimento para analisar os perfis de metilação em todo o genoma a nível de nucleótido único. O método pode reduzir o número de nucleótidos necessários para sequenciar para 1% do genoma (Meissner et al.., 2005). Devido à sua forma económica e produtiva, RRBS tem sido utilizado na análise rápida de metilação aberrante no câncer (Smith et al.., 2009) e estados de metilação no desenvolvimento.

Fluxo de Trabalho do RRBS

O protocolo de RRBS é ilustrado na Figura 6. O processo consiste em várias etapas:

• Digestão enzimática O DNA genómico é digerido em fragmentos de DNA de vários tamanhos utilizando uma enzima de restrição insensível à metilação. A MspI é frequentemente utilizada.
• Preparação da biblioteca Após a digestão enzimática, a preparação da biblioteca, um processo que consiste na reparação das extremidades, adição de A e ligação do adaptador de sequenciação, é realizada. A reação da digestão com MspI resulta em cadeias com extremidades pegajosas. A reparação das extremidades é necessária para preencher o terminal 3’ das extremidades das cadeias. A adição de A, na qual uma adenosina extra é adicionada tanto às cadeias positivas como às negativas, é necessária para a ligação do adaptador de sequência metilado na etapa seguinte.
• Seleção de tamanho Posteriormente, é realizada uma seleção de tamanhos dos fragmentos resultantes. Diferentes tamanhos dos fragmentos são separados utilizando eletroforese em gel e são purificados através da excisão do gel.
• Conversão de bisulfito Após a seleção do tamanho, é realizada a conversão de bisulfito, na qual a citosina não metilada é desaminada em uracilo.
• Amplificação e purificação de PCR O DNA convertido em bisulfito é então amplificado utilizando PCR com primers que são complementares aos adaptadores de sequência. Um passo de purificação por PCR é necessário antes da sequenciação.
• Sequenciação A sequenciação é então realizada utilizando tecnologia de sequenciação de nova geração. As plataformas Illumina são as mais frequentemente utilizadas.

Figura 6. Protocolo de Sequenciação de Bisulfito de Representação Reduzida.

Vantagens e Limitações do RRBS

O RRBS tem algumas vantagens técnicas em relação ao WGBS e a outros métodos de deteção de metilação do DNA. Mas também existem algumas limitações nos passos específicos do protocolo.

• Vantagens:
• Aproveitando o uso de enzimas de restrição específicas, o RRBS pode enriquecer regiões CpG do genoma, reduzindo a quantidade de sequenciação necessária, bem como diminuindo o custo.
• Apenas é necessária uma baixa concentração de amostra para uma análise de dados precisa.
• Limitações
• A digestão com enzimas de restrição não conseguiu abranger todas as regiões CG no genoma. Alguns CpG foram perdidos e algumas regiões, assim, têm uma cobertura mais baixa.
• Podem ocorrer erros na amplificação por PCR.
• A conversão completa de bisulfito de DNA de cadeia dupla (dsDNA) requer um passo de desnaturação, uma vez que o sequenciamento de bisulfito apenas converte DNA de cadeia simples (ssDNA).

Na CD Genomics, estamos dedicados a fornecer soluções fiáveis. sequenciação epigenómica serviços, incluindo sequenciação de bisulfito direcionada, sequenciação de bisulfito com representação reduzida (RRBS), sequenciação de bisulfito de genoma completo, Sequenciação MeDIP, e ChIP-seq.

Referências:

1. Cloney, R. (2016). Metilação de DNA: Uma análise SMRT dos epigenomas procarióticos. Nature Reviews Genetics dezessete, 195.
2. Cooper, D.N. (1983). Metilação de DNA eucariótico. Genética humana 64, 315-333.
3. Frommer, M., McDonald, L.E., Millar, D.S., Collis, C.M., Watt, F., Grigg, G.W., Molloy, P.L., e Paul, C.L. (1992). Um protocolo de sequenciação genómica que produz uma exibição positiva de resíduos de 5-metilcitosina em cadeias de DNA individuais. Atas da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América oitenta e nove, 1827-1831.
4. Harris, R.A., Wang, T., Coarfa, C., Nagarajan, R.P., Hong, C., Downey, S.L., Johnson, B.E., Fouse, S.D., Delaney, A., Zhao, Y.et al. (2010). Comparação de métodos baseados em sequenciação para perfilar a metilação do DNA e identificação de modificações epigenéticas monoalélicas. Biotecnologia da Natureza 28, 1097-1105.
5. Kurdyukov, S., e Bullock, M. (2016). Análise de Metilação de DNA: Escolhendo o Método Certo. Biologia 5.
6. Meissner, A., Gnirke, A., Bell, G.W., Ramsahoye, B., Lander, E.S., e Jaenisch, R. (2005). Sequenciação de bisulfito de representação reduzida para análise comparativa de metilação de DNA em alta resolução. Pesquisa em ácidos nucleicos 33, 5868-5877.
7. Mukherjee, K., Twyman, R.M., e Vilcinskas, A. (2015). Insetos como modelos para estudar a base epigenética da doença. Progresso em biofísica e biologia molecular cento e dezoito, 69-78.
8. Ratel, D., Ravanat, J.L., Berger, F., e Wion, D. (2006). N6-metiladenina: a outra base metilada do DNA. BioEssays: notícias e revisões em biologia molecular, celular e do desenvolvimento 28, 309-315.
9. Robertson, K.D. (2005). Metilação do DNA e doença humana. Nature Reviews Genetics 6, 597-610.
10. Smith, Z.D., Gu, H., Bock, C., Gnirke, A., e Meissner, A. (2009). Sequenciação de bisulfito de alto rendimento em genomas de mamíferos. Métodos 48, 226-232.
11. Wang, Y.P., e Lei, Q.Y. (2018). Recodificação metabólica da epigenética no câncer. Comunicações sobre o câncer 38, 25.
12. Wu, T.P., Wang, T., Seetin, M.G., Lai, Y., Zhu, S., Lin, K., Liu, Y., Byrum, S.D., Mackintosh, S.G., Zhong, M.e outros. (2016). Metilação de DNA na N(6)-adenina em células estaminais embrionárias de mamíferos. Natureza 532, 329-333.