O que é Farmacogenómica?

Farmacogenómica

A farmacogenómica representa um campo de vanguarda que une a farmacologia molecular e a genómica funcional, surgindo no final da década de 1990. O seu objetivo principal reside em melhorar a eficácia e a segurança dos medicamentos, ao mesmo tempo que analisa o impacto das variações genéticas nas respostas individuais aos fármacos, refinando assim a utilização racional dos produtos farmacêuticos.

Um resumo dos mecanismos pelos quais a variação genómica pode influenciar a farmacocinética e/ou farmacodinâmica de um fármaco, com exemplos de pares fármaco-gene clinicamente relevantes. (Rollinson et al., 2020)

A História da Farmacogenómica

A farmacogenómica tem as suas origens em 1957, quando Arno Motulsky da Universidade de Washington e Werner Kalow da Universidade de Toronto postularam que as variações genéticas na atividade enzimática entre indivíduos poderiam levar a respostas diversas ou até mesmo contrastantes a medicamentos. No entanto, só em 1997 foram feitos avanços significativos na compreensão do papel das enzimas do citocromo P450 (CYP450s) no metabolismo de fármacos. Um professor associado de farmácia na Universidade de Washington descobriu que, para a maioria dos medicamentos, a atividade dos CYP450s determina tanto a duração quanto a concentração da presença do fármaco no corpo. Seis citocromos distintos—CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 e CYP3A4—desempenham papéis cruciais na metabolização de fármacos, com correlações notáveis identificadas entre polimorfismos em CYP2C9, CYP2C19 e CYP2D6 e variações interindividuais.

Em 1997, a Genset e os Laboratórios Abbott (Abbott Park, IL) firmaram um acordo para desenvolver e promover em conjunto kits de diagnóstico genético destinados a avaliar a eficácia de medicamentos em pacientes, marcando um momento crucial no avanço da farmacogenómica. O termo "farmacogenómica" foi introduzido em 1999, marcando o reconhecimento formal deste campo em crescimento. Desde então, a pesquisa contínua tem progressivamente elucidado a intrincada relação entre polimorfismos genéticos e variações individuais na resposta a medicamentos, sublinhando o potencial transformador da farmacogenómica na medicina personalizada.

Aplicações da Farmacogenómica

A farmacogenómica investiga a complexa interação entre a informação genómica humana e as respostas a medicamentos, com o objetivo de decifrar as causas subjacentes das variações individualizadas na ação dos fármacos. Ao aproveitar os conhecimentos genómicos, a farmacogenómica procura abrir caminho para o desenvolvimento de novos medicamentos e a realização de regimes de medicação personalizados de acordo com as necessidades individuais. Estas variações abrangem uma gama de fatores, incluindo a sensibilidade individual a medicamentos, taxas metabólicas e suscetibilidade a reações adversas ou toxicidade.

As áreas-chave de foco dentro da farmacogenómica incluem:

• Previsão da Sensibilidade a Medicamentos: Através da avaliação de marcadores genéticos, a farmacogenómica procura prever a sensibilidade de um indivíduo a determinados medicamentos, melhorando assim a previsão da eficácia dos fármacos.
• Previsão da Taxa Metabólica: Ao examinar o papel das enzimas metabolizadoras e dos transportadores codificados por variações genéticas, a farmacogenómica visa prever a taxa à qual um fármaco é metabolizado no corpo. Esta compreensão ajuda a otimizar esquemas de dosagem adaptados a perfis metabólicos individuais.
• Antecipação de Reações Adversas a Medicamentos: A Farmacogenómica procura identificar marcadores genéticos associados a reações adversas a medicamentos, facilitando a evitação ou mitigação de potenciais complicações relacionadas com fármacos.

Em essência, a farmacogenómica promete revolucionar o campo da medicina ao inaugurar uma era de terapias personalizadas, onde os tratamentos são precisamente adaptados ao perfil genético individual, maximizando a eficácia enquanto minimizam os efeitos adversos.

Farmacogenómica: Compreender o seu Impacto nos Efeitos dos Medicamentos

polimorfismos genéticos, que desempenham um papel crucial na variabilidade da resposta aos medicamentos entre indivíduos. polimorfismos de nucleótido único (SNPs).

O Projeto Genoma Humano revelou que as sequências genéticas dos indivíduos diferem apenas uma em mil, resultando em aproximadamente 3 milhões de variantes. Estas variantes, ou polimorfismos, ocorrem a uma taxa de aproximadamente uma variante por 500-1000 bases no genoma, dando origem a genótipos distintos que determinam a suscetibilidade dos indivíduos a doenças e as suas respostas únicas a medicamentos.

Os SNPs, que representam variações em um único nucleótido dentro da sequência de DNA, ocorrem com uma frequência superior a 1% na população. Quando um nucleótido, como A, é substituído por qualquer um dos outros três nucleótidos (C/T/G), isso dá origem a SNPs, representando as menores diferenças genéticas entre indivíduos. Notavelmente, 90% da diversidade genética humana é atribuída a SNPs, com a farmacogenómica a analisar extensivamente as diferenças interindividuais em medicamentos a partir de uma perspetiva de SNP.

A pesquisa em farmacogenómica foca predominantemente em quatro categorias de genes relacionados com medicamentos: (1) enzimas envolvidas nas vias de metabolismo de fármacos, (2) recetores (proteínas-alvo) que interagem com medicamentos, como o ADRB2, (3) canais de transporte de fármacos, como o gene MDR1, e (4) proteínas relacionadas com sinalização. Vale a pena notar que uma proporção significativa—59%—das reações adversas a medicamentos resulta de polimorfismos genéticos em enzimas metabolizadoras de fármacos.

Tecnologias de Farmacogenómica

Com os avanços em genómica e a implementação de várias iniciativas baseadas no genoma, a viabilidade dos testes farmacogenéticos foi firmemente estabelecida através do design de sondas direcionadas a genes relacionados com medicamentos e da subsequente validação clínica. A identificação de variações genéticas abrange numerosos métodos, amplamente categorizados em duas abordagens principais.

A primeira categoria compreende métodos tradicionais baseados na eletroforese em gel, incluindo polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (PCR-RFLP), polimorfismo de conformação de cadeia simples (PCR-SSCP), eletroforese em gel com gradiente desnaturalizante (PCR-DGGE) e PCR específica para alelos (AS-PCR). Estes métodos têm sido utilizados há muito tempo na análise genética, mas podem ser trabalhosos e demorados.

Em contraste, a segunda categoria abrange o sequenciamento de alto rendimento e a automação, representando desenvolvimentos mais recentes na análise genética. Técnicas como o sequenciamento de Sanger, a deteção por microarranjos de ADN, o sequenciamento de nova geração, a cromatografia líquida de alto desempenho em condições desnaturantes (DHPLC) e a espectrometria de massa por desorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) oferecem maior rendimento e automação, simplificando o processo de análise genética. Estes métodos avançados permitem a triagem rápida e eficiente de variações genéticas, facilitando a adoção generalizada de testes farmacogenéticos na prática clínica.

De Testes Reativos a Testes Preemptivos

Os testes reativos apresentam desvantagens significativas, centradas principalmente nos atrasos na tomada de decisões inerentes ao processo de teste. Este atraso pode levar a escolhas de tratamento inadequadas, resultando potencialmente em toxicidade medicamentosa ou ineficácia. Por exemplo, a administração de clopidogrel em pacientes de PCI de emergência sem conhecimento prévio do seu genótipo CYP2C19 sublinha este problema. Por outro lado, os testes preemptivos garantem que os resultados dos testes farmacogenéticos estejam prontamente disponíveis no registo médico do paciente antes da prescrição. Esta abordagem proativa abrange tanto testes de um único gene como, de forma mais proeminente, testes de painel ou de exoma completo, abrangendo múltiplos genes farmacogenéticos acionáveis.

Comparado com o teste reativo de um único gene, o teste preemptivo de painel multigénico oferece várias vantagens. Em primeiro lugar, melhora a eficiência ao eliminar a necessidade de múltiplas amostras de pacientes e isolamentos de DNA, uma vez que um único painel farmacogenético é suficiente. Em segundo lugar, elimina atrasos terapêuticos, uma vez que os resultados dos testes já estão integrados no registo médico do paciente no momento da prescrição. Notavelmente, o teste preemptivo de painel poligénico acelera ainda mais as decisões de tratamento ao incorporar proactivamente os resultados dos testes nos registos dos pacientes, negando a necessidade de aguardar o retorno dos resultados. É importante ressaltar que o teste farmacogenómico é tipicamente um esforço único, com resultados individuais recuperáveis conforme necessário em cenários médicos subsequentes.

Atualmente, a adoção de tecnologia NGS Os testes em farmacogenómica continuam limitados devido ao custo, à complexidade tecnológica e aos desafios na interpretação dos resultados. No entanto, a crescente acessibilidade e utilização de sequenciação de alto rendimento prenunciam um futuro em que os testes farmacogenéticos, particularmente os testes preventivos, se tornem comuns.

Técnicas de Genotipagem: PCR-RFLP

A análise da reação em cadeia da polimerase/fragmentos de comprimento polimórfico cleavados por endonucleases de restrição (PCR-RFLP) é comumente utilizada para genotipagem de SNPs prevalentes dentro de genes. Este método, embora ainda utilizado em contextos de pesquisa, apresenta desafios em termos de complexidade e intensidade de trabalho, tornando-o inadequado para diagnósticos clínicos de rotina ou aplicações de alto rendimento. Além disso, devido à necessidade de manipular tubos de reação após a PCR e tratar primers com enzimas de restrição, há um risco aumentado de contaminação cruzada da PCR. Como precaução, a segregação física entre a preparação de amostras, a configuração da PCR e a análise pós-PCR é imperativa para prevenir resultados falso-positivos decorrentes de contaminação.

• Princípios do PCR-RFLP

Embora certas variantes de sequência, como alterações de uma única base, possam não alterar o comprimento do DNA, elas podem criar ou interromper locais de reconhecimento para endonucleases. A PCR amplifica a sequência alvo, após a qual o produto da amplificação é submetido a digestão com endonucleases de restrição para determinar alterações no local de restrição. O estado do local pode ser discernido através da eletroforese em gel do produto da digestão. Por exemplo, uma amostra que contém uma variante que interrompe o local de reconhecimento da enzima produzirá um fragmento de PCR não cortado, ao contrário de uma amostra que não possui a variante, que produz dois fragmentos mais curtos. Em casos de heterozigose (presença de um alelo normal e um alelo variante), observa-se um fragmento longo e dois fragmentos mais curtos. Este ensaio pode ser projetado para facilitar a diferenciação fácil dos fragmentos através da eletroforese em agarose.

PCR específica para alelos (AS-PCR)

A PCR específica para alelos (AS-PCR) aproveita as eficiências de amplificação distintas de dois primers homólogos que diferem apenas nas suas posições terminais 3', com cada primer a complementar precisamente o alelo normal ou variante. A análise dos produtos da reação normalmente utiliza métodos baseados em gel ou, mais comumente, PCR em tempo real homogénea utilizando corantes fluorescentes. Este último é preferido pela sua conveniência em relação à eletroforese. Geralmente, a AS-PCR baseada em corantes fluorescentes necessita de pelo menos duas reações de PCR por análise de polimorfismo. Além disso, a AS-PCR depende da otimização da seletividade da PCR para garantir que o sinal fluorescente, resultante da ligação do corante ao amplicon, reflete com precisão o produto de amplificação esperado, livre de interferências de reações secundárias indesejadas, como a dimerização de primers.

Dada a preferência pela deteção direta de polimorfismos em diagnósticos clínicos e a frequentemente necessária deteção de múltiplos polimorfismos em ensaios de genotipagem, surgiram várias técnicas de multiplexação para atender a esta demanda. Estas incluem a utilização de sondas TaqMan, sondas de hibridização e sondas Invader.

Probes TaqMan

Probes TaqMan são amplamente utilizados tanto em metodologias de genotipagem de locus único como de múltiplos loci, empregando uma abordagem de PCR homogénea baseada em sondas para a deteção direta de variantes. Entre os diversos métodos de deteção de variantes, a escolha predominante envolve sondas de hidrolise nuclease 5', comumente conhecidas como sondas TaqMan. Estas sondas, distintamente marcadas com marcadores fluorescentes, são meticulosamente projetadas para complementar perfeitamente qualquer um dos dois alelos variantes que diferem por um ou mais nucleotídeos.

Funcionalmente, estas sondas duplamente marcadas estão inicialmente apagadas devido à sua proximidade na conformação da sonda de oligonucleotídeos. Durante cada ciclo de PCR, a sonda TaqMan hibrida com a sua região-alvo e, na etapa de extensão do primer, o fluoróforo do repórter fluorescente e o fluoróforo apagado dissociam-se, emitindo fluorescência após a clivagem pela atividade nuclease 5' de uma polimerase de DNA resistente ao calor (por exemplo, Thermus aquaticus). Consequentemente, a intensidade da fluorescência, associada a cada sonda TaqMan específica de alelo, aumenta continuamente em tempo real com cada ciclo de amplificação subsequente.

A deteção de ambos os alelos, quer em estado puro quer heterozigoto, é tipicamente determinada por ciclos em que o sinal observável ultrapassa um limiar pré-definido (denotado como CT). No entanto, a capacidade de genotipar múltiplos SNPs dentro de uma única reação de PCR é mais limitada pelo número de sinais fluorescentes distintos detectáveis numa única reação do que pela capacidade de multiplexação para direcionar várias regiões simultaneamente. Esta limitação depende de fatores como a sobreposição dos espectros de emissão dos corantes fluorescentes utilizados para a rotulagem de sondas, as capacidades do hardware de deteção e a eficácia do software de correção de interferências.

Plataforma de genotipagem TaqMan

Sondas de Hibridação

As sondas de hibridização apresentam um método robusto para genotipagem fluorescente homogénea, particularmente através da análise da curva de fusão pós-PCR de sondas de hibridização específicas para alelos. Nesta abordagem, duas sondas são estrategicamente desenhadas para cada local SNP: a sonda de ancoragem liga-se seletivamente a sequências próximas ao local SNP, enquanto a sonda de deteção de SNP reconhece especificamente a sequência que contém o SNP. Aproveitando o princípio da transferência de energia de ressonância fluorescente (FRET), a sonda de ancoragem é marcada com um corante fluorescente doador em uma extremidade, enquanto a sonda de deteção de SNP carrega um corante aceitador na outra extremidade. As sondas são desenhadas para hibridizar de forma otimizada a uma temperatura propícia para que se liguem uma à outra no produto da PCR, facilitando a geração de sinal fluorescente durante e após a PCR.

A detección de SNP baseia-se na análise de curvas de fusão, uma técnica que discrimina entre diferentes formas alélicas de DNA com base nas suas temperaturas de fusão. Especificamente, as sondas de deteção de SNP são projetadas para apresentar temperaturas de fusão distintas das dos SNPs do tipo selvagem e variantes. À medida que a temperatura varia, a sonda dissocia-se da sequência alvo a uma temperatura de fusão específica, dependendo da composição alélica do SNP. Os perfis de fusão resultantes, únicos para cada SNP, permitem a deteção e caracterização dos tipos de SNP.

Microarranjo de Genes

Nas técnicas baseadas em hibridização, o processo inicia-se com a isolação do DNA genómico, seguido pela amplificação por PCR da região de interesse. Subsequentemente, o alvo amplificado é fragmentado utilizando a enzima DNase I e rotulado nas extremidades com biotina. Este produto rotulado é então submetido a hibridização com oligonucleotídeos específicos de alelos em um substrato sólido, como esferas ou microarranjos, sob condições rigorosas. Estes oligonucleotídeos específicos de alelos, que diferem apenas por uma ou duas bases, correspondem aos vários alelos do fragmento de DNA em exame. O ambiente da reação é cuidadosamente controlado para permitir a remoção de alvos não correspondentes, garantindo que apenas os fragmentos de DNA hibridizados de forma perfeita permaneçam, os quais são então rotulados fluorescentemente. A fluorescência associada a características específicas da sonda é detectada utilizando um scanner confocal iluminado a laser.

Para aumentar a especificidade do ensaio, múltiplas sondas são frequentemente utilizadas para cada alelo SNP. Ensaios baseados em microarrays de oligonucleotídeos normalmente aproveitam sinais de fluorescência comparativa entre conjuntos de oligonucleotídeos perfeitamente emparelhados e desalinhados para detectar polimorfismos enquanto mitigam os efeitos da hibridização cruzada. A identificação de polimorfismos, alelos e genótipos dentro de uma amostra é facilitada por software e algoritmos de treino, utilizando amostras com genótipos conhecidos. Por exemplo, esta metodologia foi aplicada no desenvolvimento do ensaio de genotipagem AmpliChip CYP450.

O microarray de genes o método permite a deteção simultânea de quase todos os polimorfismos e alelos conhecidos do CYP2D6 através de reações de PCR longa multiplexadas. Estas reações amplificam a região promotora e a região codificadora do CYP2D6, juntamente com reações específicas adaptadas para detectar uma deleção do gene CYP2D6 de 3,5 kb ou uma duplicação do gene CYP2D6.

Sequenciação de Sanger

Sequenciação de Sanger revolucionou a análise genética quando foi introduzida por Sanger et al. em 1977. Ao longo dos anos, esta tecnologia passou por um refinamento e automação significativos, culminando nas avançadas plataformas de sequenciação Sanger de hoje. A sequenciação Sanger moderna utiliza corantes fluorescentes de quatro cores para a marcação de ddNTP, juntamente com eletroforese capilar para separar precisamente fragmentos de ADN. Esses avanços melhoraram substancialmente a conveniência, segurança e capacidade de processamento dos procedimentos de sequenciação.

Reconhecido como um método clássico para a análise de sequências de DNA, o sequenciamento de Sanger é amplamente considerado o padrão-ouro para genotipagem devido à sua capacidade de ler diretamente sequências de DNA. Esta versatilidade torna-o adequado para detectar várias variações genéticas, incluindo polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), repetições em tandem curtas (STRs), polimorfismos de sequência de repetição Alu (ARPs) e tipagem HLA-B.

Notavelmente, vários reagentes de diagnóstico in vitro (IVD) de classe III baseados em sequenciação Sanger receberam aprovação de agências reguladoras como a Administração Nacional de Produtos Médicos (NMPA). Estes reagentes facilitam a deteção de variações genéticas em loci como UGT1A1, ALDH2, MTHFR, CYP2C19, CYP2C9, VKORC1, entre outros, sublinhando a ampla aplicabilidade e utilidade clínica da sequenciação Sanger em diagnósticos moleculares.

Sequenciação de Nova Geração (NGS)

Sequenciação de alto débito, também conhecida como sequenciação de nova geração (NGS) ou sequenciação massivamente paralela (MPS), representa um avanço revolucionário em relação à sequenciação de Sanger. Esta abordagem inovadora capitaliza a sequenciação paralela, permitindo a sequenciação simultânea de milhões ou até bilhões de fragmentos de DNA, alcançando assim objetivos de sequenciação em larga escala e de alto rendimento. Tecnologias NGS comercializadas proeminentes, como a tecnologia Solexa da Illumina e a tecnologia Ion Torrent da Thermo, dominam o panorama das plataformas de sequenciação de alto rendimento.

A principal vantagem do sequenciamento de alto rendimento reside na sua capacidade de alcançar um rendimento notável enquanto deteta simultaneamente várias variações genéticas, incluindo polimorfismos de nucleótido único (SNPs), variações no número de cópias (CNVs), repetições em tandem curtas (STRs), repetições Alu e tipagem HLA-B. No entanto, o método também apresenta vários desafios. A instrumentação é dispendiosa e os custos dos reagentes podem ser substanciais. Além disso, a complexidade do processo de deteção, juntamente com os requisitos rigorosos para instalações laboratoriais e operadores qualificados, representa obstáculos práticos. Além disso, a análise de dados pode ser complexa, dificultando a adoção generalizada.

Sequenciação de alto rendimento encontra uma utilidade particular em aplicações que envolvem a deteção de variantes genéticas em várias regiões genéticas ou a identificação de mutações presentes em baixas frequências. Apesar das suas complexidades e limitações, o sequenciamento de alto rendimento está na vanguarda da análise genética, impulsionando avanços em diagnósticos moleculares e esforços de investigação.

Uma representação esquemática do fluxo de trabalho da farmacogenómica clínica descrito aqui. (Giannopoulou et al., 2019)

Em resumo

Nos últimos anos, o surgimento de abordagens multi-ômicas revolucionou a nossa capacidade de prever doenças e prever respostas a medicamentos, facilitando diagnósticos e estratégias de tratamento precisos. Entre essas tecnologias multi-ômicas, a farmacogenómica destaca-se ao elucidar a complexa interação entre a informação genética e a farmacocinética/farmacodinâmica (PK/PD) dos medicamentos através de Sequenciação de ADN dados.

Quando integrados em estudos de associação genómica, a transcriptómica, a proteómica, a epigenética e a metabolómica têm um enorme potencial para descobrir fatores genéticos que predispõem indivíduos a doenças multifatoriais e a respostas variadas a medicamentos. Esta abordagem abrangente permite a identificação precoce de populações suscetíveis, abrindo caminho para intervenções direcionadas que visam melhorar a segurança dos medicamentos, a eficácia e mitigar efeitos adversos.

Além disso, a fusão da proteómica e da metabolómica aprimora ainda mais a nossa capacidade de discernir os fatores genéticos associados a doenças multifatoriais e reações a medicamentos. Ao permitir intervenções precoces adaptadas a populações suscetíveis, esta abordagem integrativa promove terapias medicamentosas otimizadas que maximizam a eficácia enquanto minimizam a toxicidade. Em última análise, isso nos impulsiona em direção à realização de tratamentos medicamentosos individualizados que sejam seguros, eficazes e economicamente viáveis, promovendo assim uma melhor saúde e bem-estar humano.

Referências:

1. Rollinson, Victoria, Richard Turner, e Munir Pirmohamed. "Farmacogenómica para cuidados primários: uma visão geral." Genes 11.11 (2020): 1337.
2. Giannopoulou, Efstathia, et al. "Integração do sequenciamento de nova geração no fluxo de trabalho da farmacogenómica clínica." Fronteiras em farmacologia 10 (2019): 384.