Tecnologias de Sequenciação para o Hotspot da Epigenómica Microbiana – DNA N6-metiladenina

A base modificada mais prevalente no DNA bacteriano é N6-metiladenina e envolve funções na regulação de processos de modificação (RM), reparação de DNA de nova cadeia e controlo da expressão génica. A virulência e as relações entre bactérias e células hospedeiras podem ser causadas por mutações em metiltransferases e sobreexpressão. Nenhuma enzima é capaz de desmetilar o DNA m6A. in vivo, mas a ligação competitiva de proteínas em locais-alvo pode influenciar a metilação e, assim, modificar a transcrição em células recém-replicadas. Mutacões de deslocamento de quadro também podem levar a progressos na expressão genética envolvida na formação da parede celular e restaurar vias em regiões repetitivas nos genes metiltransferases. Esses mecanismos de variação de etapas podem ajudar as bactérias a evitar as defesas do hospedeiro mamífero, mas ainda não está claro se os deslocamentos de quadro das metiltransferases levam à tolerância a outras condições.

Antes do advento da sequenciação de moléculas únicas, digestões de restrição ou sequenciação após imunoprecipitação eram utilizadas em técnicas para avaliar m6A no DNA. Um teste é utilizado para diferenciar a cinética da DNA polimerase envolvendo bases metiladas e moldes para bases não metiladas, calculado como um período inter-pulso (IPD) em a análise em tempo real de molécula única (SMRT) pipeline para resultados de sequenciação PacBio. Vários grupos também demonstraram que pequenas melhorias nos impulsos elétricos à medida que o DNA passa por nanoporos irão expor a existência de modificações de bases utilizando sequenciadores produzidos por Oxford Nanopore Technologies (ONT).

Técnicas para Sequenciamento de N6-Metiladenina

Sequenciação SMRTA sequenciação SMRT da PacBio depende da sequenciação por síntese, na qual a sequência de um molde de DNA circular é definida a partir da série de pulsos de fluorescência, cada um resultante de uma polimerase fixada ao fundo de um poço que adiciona um nucleótido nomeado. Assim, as alterações de base não mudam a sequência da base rotulada, mas alteram a cinética da polimerase. As alterações de base podem ser derivadas do contraste entre um protótipo alterado e um modelo in silico ou um protótipo não modificado, avaliando o comprimento entre pulsos. Por exemplo, a presença de 6mA na fita molde parece dificultar a integração do T complementar pela polimerase. Os padrões de interrupção cinética podem ser mais complicados e dependentes do contexto, enquanto o ajuste de base muitas vezes depende da gravidade das perturbações. Estas características fazem com que a SMRT detecte de forma mais sensível 4mC e 6mA, tornando-a útil para a epigenómica bacteriana. A sequenciação SMRT aumentou significativamente o número de metiltransferases identificadas desde 2012. A sequenciação SMRT também tem sido utilizada em Leishmania para diagnosticar a base J (β-d-glucosil-hidroximetiluracilo) e tem a capacidade de analisar melhorias inexplicadas.

Sequenciação por nanoporoQuando um ácido nucleico de cadeia simples é apertado, a sequenciação por nanoporo da ONT testa a diferença da corrente iónica através de um nanoporo biológico. Numa metodologia chamada base-calling, redes neurais convertem a trilha presente em nucleotídeos. As modificações na base do DNA adicionam anomalias ao sinal bruto, tornando-as observáveis. O Nanopolish é um kit de software de análise a nível de sinal para dados de sequenciação da Oxford Nanopore que pode identificar 5mCG com um algoritmo pré-treinado. Uma vez que o Nanopolish combina um modelo de 5mCG, além da amostra alvo, não há necessidade de sequenciar uma unidade amplificada por PCR e não modificada. Com uma leitura única, quase à resolução de um único nucleótido, o Nanopolish gera a probabilidade de que uma base seja alterada.

Três medidas estão envolvidas na identificação de modificações de bases na sequenciação por nanoporo: (1) chamada de base com bases canónicas, (2) ligação do sinal bruto a uma referência genética, e (3) avaliação da prova de que uma base foi alterada. Até agora, a sequenciação por nanoporo apresenta melhor desempenho na deteção de 5mCG, enquanto a precisão de m6A é comparável à do PacBio. E também, em comparação com o SMRT, o custo reduzido por Gb torna-a ideal para genomas maiores.

Referências:

1. O'Brown, Z.K., Boulias, K., Wang, J. et al. Fontes de artefactos nas medições de 6mA e 4mC de abundância no DNA genómico eucariótico. BMC Genómica. 2019, 20, 445.
2. Quentin Gouil, Andrew Keniry; Técnicas mais recentes para estudar a metilação do DNA. Ensaios de Bioquímica. 2019, 63 (6): 639–648.
3. Chuan-Le Xiao, et al. Sequenciação com resolução de nucleótido único de N6-metil-desoxiadenosina humana revela clusters assimétricos de fita associados ao SSBP1 no genoma mitocondrial, 2018.