O que é o RNA m6A

O que é a modificação m6A?

Metilação de RNA destaca-se como um foco crucial no âmbito da epigenética. Com um repertório que ultrapassa 100 modificações distintas, exemplos notáveis incluem a metilação, hidroximetilação e acetilação. Dentre estas, a m6A é a modificação de metilação mais prevalente no RNA, com uma média de 1 a 3 modificações m6A por transcrito. Presente em todos os eucariotos, abrangendo mamíferos, insetos, plantas, leveduras e alguns vírus, a m6A ocorre não apenas no mRNA, mas também no tRNA, rRNA, RNA nuclear pequeno e várias RNAs longas não codificantes. A metilação do RNA está prestes a exercer uma influência significativa sobre a regulação da expressão génica, splicing, edição de RNA, estabilidade, turnover de mRNA e processos de degradação.

A metilação m6A (N6-metiladenosina) denota o processo pelo qual moléculas de RNA, sob a influência catalítica do complexo de metiltransferase de RNA (MTC), adicionam seletivamente um grupo metilo à posição N6 da adenosina. As bases que sofreram modificação m6A podem passar por desmetilação através da ação de duas enzimas, FTO e ALKBH.

N6-metiladenosina (Roundtree et al (2017) Cell)

Qual é a função da metilação m6A?

Regulação da Diferenciação de Células-Tronco Hematopoiéticas pela Modificação de Metilação de RNA (m6A)

O modificação m6Amediada pela METTL3, desempenha um papel crucial em vários processos biológicos e no desenvolvimento individual em eucariotos, incluindo ritmos circadianos, resposta a danos no DNA, regulação da auto-renovação e pluripotência das células-tronco, transição de materno para zigoto, neuroregulação em Drosófila e determinação do sexo, e desenvolvimento embrionário precoce em ratos. A descoberta de metiltransferases de RNA, proteínas de ligação e seu envolvimento no metabolismo e processamento de RNA sublinha as funções biológicas significativas associadas à modificação de metilação do RNA.

Nos vertebrados, as células-tronco hematopoiéticas originam-se do endotélio hemogénico especializado através do processo de transição endotelial-hematopoiética (EHT) durante o desenvolvimento embrionário na região da aorta-gónada-mesonefro. Subsequentemente, migram e proliferam dentro dos tecidos hematopoiéticos, depois migram para o timo para se desenvolverem em células linfoides e, por fim, migram para a medula óssea (em ratos e humanos) ou medula renal (em zebrafish) para sustentar a hematopoiese ao longo da vida. Utilizando técnicas de sequenciação MeRIP-seq e miCLIP-seq com resolução de nucleotídeos únicos para m6A com anticorpos m6A, foi construído um mapa detalhado da modificação m6A durante o desenvolvimento embrionário de zebrafish. Descobriu-se que o m6A modifica seletivamente genes-chave como o notch1a durante a transição endotelial-hematopoiética, recrutando a proteína de ligação YTHDF2 para a degradação de mRNA, inibindo assim a via de sinalização Notch e promovendo a progressão ordenada da transição endotelial-hematopoiética, facilitando a conversão de células endoteliais em células-tronco/progenitoras hematopoiéticas (HSPCs). Em embriões de zebrafish com deficiência de mettl3, o nível de modificação m6A diminuiu significativamente, e o notch1a não pôde ser degradado normalmente, levando à ativação sustentada da via de sinalização Notch e, em última análise, resultando na falha das células endoteliais em se converterem em células-tronco/progenitoras hematopoiéticas. Além disso, embriões de ratos knockout de Mettl3 exibiram fenótipos semelhantes. Estes resultados elucidam o mecanismo regulatório da modificação de metilação m6A do mRNA na determinação do destino das células-tronco hematopoiéticas vertebradas, destacando o papel crítico da modificação epigenética do RNA no desenvolvimento hematopoiético.

A Modificação de Metilação do RNA (m6A) Regula a Espermatozoogénese

A função biológica de modificação m6A mediado por Mettl3 no desenvolvimento de tecidos mamíferos permanece elusivo devido à letalidade da remoção do Mettl3 em embriões de rato precoces. Aqui, estabelecemos um modelo de rato com deleção específica de Mettl3 em células germinativas (Vasa-Cre), denominado knockout condicional de Mettl3 (Mettl3CKO), utilizando recombinação homóloga facilitada pelo sistema CRISPR/Cas9 e o sistema Cre-loxP. Através deste modelo, investigámos sistematicamente o papel crucial e o mecanismo regulador da modificação m6A mediada pelo METTL3 na espermatogénese de ratos. A análise histológica através de coloração H&E (hematoxilina e eosina), coloração por imunofluorescência e análise de espalhamento cromossómico revelou que a deleção de Mettl3 suprimia a diferenciação das células-tronco espermatogoniais de rato e a iniciação da meiose, levando, em última instância, à infertilidade masculina. A análise de RNA-seq, m6AmiCLIP-seq e bioinformática demonstrou que a deficiência de Mettl3 resultou em níveis reduzidos de m6A, causando splicing alternativo aberrante de RNA de genes relacionados com a manutenção e diferenciação das células-tronco espermatogoniais, ciclo celular e meiose, bem como uma disrupção geral da expressão génica nas células germinativas, impedindo assim a espermatogénese. Estas descobertas sublinham a função biológica crucial da modificação m6A mediada pela metiltransferase de RNA METTL3 na espermatogénese de ratos.

A remoção específica de Mettl3 ou Mettl14 em células germinativas de rato utilizando Vasa-Cre levou a níveis reduzidos de m6A, perturbando a função de tradução de transcritos associados à proliferação e diferenciação de células-tronco espermatogoniais, resultando na depleção dessas células. A remoção simultânea de Mettl3 e Mettl14 usando Stra8-GFPCre interrompeu a tradução de genes específicos haploides durante a espermatogénese, resultando em espermatogénese prejudicada. Além disso, machos de ratos Alkbh5-/- exibiram fenótipos como atrofia testicular, espermatogénese anormal e motilidade espermática comprometida. Um aumento no número de espermatócitos primários e secundários foi observado nos túbulos seminíferos no estágio VII de desenvolvimento, acompanhado por uma diminuição de espermatídios redondos e esperma maduro, bem como apoptose celular. Ratos knockout de Ythdc2 mostraram apoptose excessiva em espermatócitos precoces durante a prófase meiótica, levando à atrofia testicular e desenvolvimento anormal de esperma. A capacidade de ligação ao m6A e a atividade de helicase 3′→5′ de YTHDC2 desempenham papéis regulatórios cruciais na manutenção do padrão correto de expressão de genes relacionados à meiose durante a espermatogénese. Coletivamente, estes estudos destacam o equilíbrio dinâmico da modificação de metilação do RNA m6A como um fator regulatório crucial no processo de desenvolvimento de gametas (espermatozoides).

A Modificação de Metilação do RNA (m6A) Regula o Desenvolvimento Cerebral

O modificação m6A desempenha um papel regulador indispensável tanto no desenvolvimento como na função do sistema nervoso. A deleção do gene Ime4 em moscas-da-fruta resulta em indivíduos viáveis, mas de vida mais curta, apresentando anomalias comportamentais significativas, indicando o impacto da perda da modificação m6A na neurofuncionalidade das moscas-da-fruta. A deleção específica do gene Mettl14 no sistema nervoso central de ratos afeta severamente o desenvolvimento do córtex cerebral. A perda do gene Ythdf2 em ratos leva a um aumento geral nos níveis de m6A, impedindo que fatores cruciais envolvidos na diferenciação de células-tronco neurais e na formação de dendritos entrem na via normal de degradação do RNA. Consequentemente, essa interrupção resulta em uma divisão assimétrica prejudicada das células-tronco neurais corticais, causando uma perda significativa de células precursoras neurais e afetando severamente a diferenciação neuronal, levando, em última análise, a um desenvolvimento lento do córtex cerebral do prosencéfalo em ratos. Para além do córtex cerebral, o padrão e o nível de metilação m6A do RNA no cerebelo são particularmente notáveis. Os processos dinâmicos de metilação e desmetilação m6A abrangem todo o desenvolvimento pós-natal do cerebelo, e a perda do gene Alkbh5 em condições de baixa pressão e baixo oxigénio perturba os níveis de m6A dos genes envolvidos na regulação do desenvolvimento cerebelar, acelerando a exportação nuclear do RNA e atrasando significativamente o desenvolvimento do cerebelo.

Para investigar o impacto da modificação de metilação m6A no desenvolvimento do sistema nervoso central, deletámos especificamente o gene Mettl3 no sistema nervoso central de ratos utilizando o sistema Cre-loxP. A deleção específica de Mettl3 no sistema nervoso central resultou em disfunção motora severa durante o período de lactação e levou à morte. A análise anatómica e histopatológica revelou que a perda da modificação de metilação m6A causada pela deleção de Mettl3 afetou gravemente o desenvolvimento do córtex cerebral e do cerebelo, resultando em afinamento cortical e maldesenvolvimento cerebelar. A perda da modificação de metilação m6A causou desregulação da expressão génica durante a diferenciação e maturação dos neurónios granulados no cerebelo, levando a uma extensa apoptose de neurónios granulados recém-nascidos, destacando o papel crucial da modificação m6A mediada pela METTL3 no desenvolvimento do sistema nervoso central dos mamíferos. Além do seu impacto no desenvolvimento do sistema nervoso central, a modificação m6A também participa na regulação do sistema nervoso adulto. A lesão axonal promove um aumento nos níveis de modificação m6A dentro das células nervosas, aumentando assim a eficiência de tradução de uma série de genes, incluindo aqueles relacionados com a regeneração axonal.

Modificação de Metilação de RNA (m6A) e Metabolismo de RNA

Um número crescente de pesquisas sugere que a m6A está intrinsecamente envolvida na regulação de vários processos do metabolismo do RNA, que vão desde o processamento do mRNA precursor no núcleo, à expressão do mRNA, até à tradução e degradação do mRNA no citoplasma. Dentro do núcleo, a m6A recruta a SRSF3 através da sua proteína de ligação YTHDC1, participando na regulação do splicing do mRNA precursor. Também modula a diversidade da poliadenilação de adenina ao regular o splicing seletivo do exon final. Além disso, o sistema enzimático de modificação da m6A, incluindo METTL3, ALKBH5 e YTHDC1, tem sido encontrado a participar na regulação dos processos de exportação do mRNA. No citoplasma, os mecanismos pelos quais a m6A regula a tradução são diversos. Isso inclui vias como a via YTHDF1-eIF3, que regula a eficiência da tradução do mRNA, bem como processos mediados pela família de proteínas IGF2BP. Em condições de stress, a m6A participa em vias regulatórias de tradução que não dependem do cap 5′. Além disso, a m6A regula a estabilidade do mRNA através de várias vias, incluindo o recrutamento do mRNA para os P-bodies para degradação pelo YTHDF2. Relatórios recentes também indicaram que a família de proteínas IGF2BP mantém a estabilidade do mRNA ao se ligar especificamente ao mRNA modificado por m6A. Adicionalmente, a m6A pode regular o metabolismo do RNA ao modular a estrutura secundária do RNA.

As Funções Biológicas da Modificação de Metilação do RNA m5C

Nos últimos anos, um número crescente de pesquisas destacou o papel regulador crucial da modificação m5C no mRNA no processamento e metabolismo do RNA, bem como em processos fisiológicos normais, incluindo o metabolismo do RNA, a diferenciação de células-tronco e as respostas ao stress. Estudos em células-tronco embrionárias de rato e no cérebro revelaram níveis e distribuições distintas da modificação m5C em diferentes estágios da diferenciação das células-tronco. Em Arabidopsis thaliana, a modificação m5C no mRNA exibe especificidade tecidual e desempenha um papel vital no desenvolvimento da planta. Plantas mutantes da metiltransferase m5C TRM4B em Arabidopsis apresentam divisão celular inibida no meristema apical da raiz, resultando em raízes mais curtas e maior sensibilidade ao stress oxidativo.

Mecanismo de Modificação M6A

Metilação de RNA A modificação representa mais de 60% de todas as modificações de RNA, sendo a m6A a modificação mais prevalente em mRNA e lncRNAs em organismos superiores. Atualmente, a modificação m6A foi identificada em microRNAs, circRNAs, rRNAs, tRNAs e snoRNAs. A ocorrência da modificação m6A tem como alvo principal as adenosinas dentro do motivo sequencial RRACH e a sua funcionalidade é regida pelos componentes "Writer", "Eraser" e "Reader". O "Writer" refere-se ao complexo de metiltransferase, que inclui componentes conhecidos como METTL3, METTL14, WTAP e KIAA1429. Por outro lado, ALKBH5 e FTO atuam como desmetilases (Erasers) capazes de reverter a metilação. A m6A é reconhecida por proteínas ligadoras de m6A (Readers), que incluem proteínas do domínio YTH (como YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3, YTHDC1 e YTHDC2) e a família de ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (HNRNP) (HNRNPA2B1 e HNRNPC). Este intrincado sistema de escritores, apagadores e leitores orquestra a paisagem regulatória da modificação m6A na biologia do RNA.

Processo dinâmico e reversível da modificação m6A e três métodos de reconhecimento dos leitores.

Metiltransferases m6A (Escritores)

As metiltransferases, também conhecidas como Escritores, constituem uma classe crucial de enzimas catalíticas responsáveis por catalisar modificações de metilação m6A no mRNA. Os Escritores facilitam a "escrita" de modificações de metil sobre o RNA, mediando assim o processo de modificação de metilação do RNA. Entre as moléculas mais comuns nesta categoria estão a METTL3 e a METTL14, ambas as quais catalisam a metilação m6A do mRNA (e de outros RNAs nucleares) tanto in vitro como in vivo. Além disso, a WTAP serve como outro componente chave dentro deste complexo de metiltransferases.

Estudos de biologia estrutural elucidaram que METTL3 e METTL14 possuem domínios catalíticos cruciais e formam um heterocomplexo. METTL3 atua como a subunidade catalítica, enquanto METTL14 desempenha um papel fundamental no reconhecimento de substratos. Além disso, WTAP, Vir e outros tipos de fatores são componentes integrais deste complexo. Notavelmente, WTAP desempenha um papel crucial na recrutaçã de METTL3 e METTL14. Estas proteínas catalisam a metilação de adenosina tanto in vivo como in vitro. Proteínas homólogas semelhantes a METTL3 e METTL14 foram descobertas não apenas em mamíferos como humanos e ratos, mas também em outros organismos, incluindo moscas da fruta, leveduras e até Arabidopsis thaliana.

Demetilases m6A (Apagadores)

Os apagadores funcionam para "apagar" modificações de metilação do RNA, mediando assim o processo de modificação de desmetilação no RNA. Em eucariotos, as demetilases m6A identificadas incluem principalmente FTO e ALKBH5. FTO e ALKBH5 são capazes de remover a metilação m6A do mRNA (e de outros RNAs nucleares).

(Ying Yang et al., 2015)

A proteína FTO partilha semelhanças estruturais com a família de proteínas Alkb no seu domínio central, no entanto, possui um laço longo único na extremidade C-terminal, distinto de outras proteínas da família Alkb. É este domínio distintivo que permite à proteína FTO catalisar modificações de desmetilação em DNA ou RNA de cadeia simples metilados. A desregulação dos níveis de transcrição do gene FTO pode levar a várias doenças, como a leucemia mieloide aguda. Outra desmetilase crucial, ALKBH5, é capaz de desmetilar mRNA no núcleo. Possui uma região N-terminal rica em alanina e uma estrutura de hélice enrolada única. A redução da expressão de ALKBH5 em linhas celulares resulta num aumento significativo nos níveis de modificação m6A no mRNA.

Leitores de Metilação m6A

Leitores: Estas proteínas "leem" a informação codificada pelas modificações de metilação do RNA e participam em processos subsequentes, como a tradução e a degradação do RNA.

Várias proteínas leitoras foram identificadas através de experiências de pull-down de RNA, incluindo proteínas que contêm domínios YTH, ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNPs) e fatores de iniciação eucarióticos (eIFs). As funções dessas proteínas leitoras envolvem principalmente a ligação específica a regiões metiladas em m6A, enfraquecendo a ligação homóloga com proteínas ligadoras de RNA e alterando a estrutura secundária do RNA, modulando assim as interações proteína-RNA.

(Ying Yang et al., 2015)

As proteínas que contêm o domínio YTH incluem YTHDC1-2 e YTHDF1-3, entre outras. YTHDF1-3 reconhece principalmente o mRNA modificado por m6A no citoplasma, enquanto as funções de YTHDC1-2 estão predominantemente localizadas no núcleo. Estas proteínas possuem um domínio YTH na extremidade C-terminal, permitindo a ligação específica ao RNA através da sobreposição com o motivo m6A. Além disso, os seus domínios ricos em prolina/glutamina/asparagina (ricos em P/Q/N) estão associados à localização subcelular.

As proteínas eIF3 podem ligar-se a bases que estão a sofrer modificação m6A no 5'UTR do RNA, promovendo assim a tradução do mRNA. Este representa um novo mecanismo quase independente da ativação tradicional do eIF4 para a iniciação da tradução. O RNA recrutado sob a ação do eIF3 forma um complexo proteico na extremidade 5' do cap, facilitando o recrutamento do ribossoma 43S.

HNRNPA2B1, um membro da família de proteínas hnRNP, mantém a funcionalidade de uma proteína leitora. Ao contrário da proteína YTHDC1, HNRNPA2B1 não se liga diretamente às bases modificadas por m6A. Além de ativar vias a jusante do miRNA primário (pri-miRNA), HNRNPA2B1 também está envolvido no processamento do pre-miRNA.

(Ying Yang et al. (2015)

Como Detetar m6A?

Os métodos de deteção para m6A são diversos, incluindo MeRIP-seq, miCLIP-seq, MeRIP-qPCR, LC-MS/MS, entre outros.

MeRIP-seqCom base na tecnologia de enriquecimento por imunoprecipitação, esta abordagem combina bibliotecas de IP e de input para a análise de modificação m6A. A biblioteca de input, semelhante às bibliotecas de RNA-seq, facilita a análise de perfis de expressão. Características técnicas: Construção de biblioteca simples, tecnologia madura.

miCLIP-seq: Utilizando a tecnologia de cruzamento UV e IP, este método alcança deteção com resolução de base única. Identifica com precisão os locais de modificação m6A usando mutações CT e pode detectar múltiplos locais de m6A dentro de um único pico. Características técnicas: Resolução de base única, requer alta qualidade e quantidade de RNA, construção de biblioteca complexa.

MeRIP-qPCR: Ao direcionar regiões específicas para a deteção de modificações m6A, este método oferece uma precisão relativamente alta. Requer a adição de padrões totalmente metilados e não metilados. Características técnicas: Abordagem direcionada, maior precisão.

Estratégia de Investigação para m6A

Identificação de Relações Relevantes:

Utilizando tecnologias de sequenciação de alto débito para caracterizar de forma abrangente a paisagem de metilação m6A:

Rastreio de alterações na abundância dos picos de m6A

Avaliação de alterações no número de genes modificados por m6A

Analisando a distribuição dos picos de m6A dentro de genes individuais

Investigando a distribuição de picos de m6A através de elementos genómicos

Realização de análise de motivos de picos de m6A

Análise funcional de genes modificados por picos de m6A

Seleção de Picos e Genes Diferenciais m6A Específicos:

Identificação de picos m6A diferenciais

Análise funcional de genes com modificações m6A diferenciais

Análise de interacção proteína-proteína (PPI) de genes com modificações m6A diferenciais

Análise das modificações m6A em genes candidatos

Integração do Methylome m6A e do Transcriptoma:

Análise de correlação entre Genes Diferencialmente Metilados (DMG) e Genes Diferencialmente Expressos (DEG)

Seleção de genes-alvo modificados por m6A

Verificação de Relações Causais:

Knockout ou superexpressão de enzimas relacionadas com m6A combinados com sequenciação do transcriptoma para identificar genes-alvo.

Validação da função do gene através de knockout e superexpressão de genes-alvo

Confirmação da regulação direta de genes-alvo por metiltransferases relevantes através da análise de mutação pontual de motivos

Perguntas Frequentes:

Quais são os efeitos das modificações m6A no mRNA?

As modificações m6A exercem efeitos diversos no mRNA. Podem modular a estabilidade do mRNA, promovendo a degradação ou aumentando a estabilidade. Além disso, as modificações m6A desempenham um papel na regulação da eficiência da tradução do mRNA, influenciando os padrões de splicing do mRNA, mediando a exportação do mRNA do núcleo para o citoplasma e controlando a localização do mRNA dentro das células.

Para mais informações, consulte "Qual é o papel da metilação m6A do RNA?"

Quais doenças estão associadas ao m6A?

A desregulação das modificações m6A está implicada em várias doenças. Estas incluem o câncer, onde padrões alterados de m6A contribuem para a iniciação, progressão e resistência a medicamentos dos tumores. Distúrbios neurológicos como a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson também apresentam associações com a desregulação do m6A. Além disso, distúrbios metabólicos como a obesidade e o diabetes, juntamente com infeções virais, estão ligados a interrupções nos processos mediadas pelo m6A.

Referências:

1. Wang, S., Lv, W., Li, T. et al. Regulação dinâmica e funções da modificação m6A do mRNA. Célula Cancerosa Int 22, 48 (2022).
2. Wang, X., Feng, J., Xue, Y. et al. Base estrutural da metilação N6-adenosina pelo complexo METTL3–METTL14. Natureza 534, 575–578 (2016).
3. Natalia Pinello, Stephanie Sun e Justin Jong-Leong Wong. Biologia do Cancro & Medicina Novembro 2018, 15 (4) 323-334