Introdução ao Iso-Seq: Revelando os Transcritos de Comprimento Completo com PacBio

A transcriptómica é um campo crucial na investigação biológica, dedicado a explorar a expressão génica e os seus mecanismos regulatórios. No seu cerne está a análise abrangente dos padrões de expressão génica em diversos tecidos, células ou condições experimentais. As tecnologias tradicionais de sequenciação de RNA de leitura curta e longa, como as oferecidas pela Illumina, enfrentam limitações devido à fragmentação. Esta fragmentação impede a cobertura completa dos transcritos de comprimento total, levando a um emaranhamento incompleto das sequências e a uma anotação gênica imprecisa. Em contraste, a sequenciação de transcritos de comprimento total fornece informações abrangentes sobre os transcritos, incluindo os exões 5' e 3', íntrons e caudas de poli-A. Esta informação detalhada permite uma compreensão mais profunda da expressão génica e dos mecanismos regulatórios.

Iso-Seq a tecnologia é um método de sequenciação do transcriptoma de comprimento total baseado em sequenciação em tempo real de molécula única (SMRT), que foi desenvolvida pela empresa PacBio. Ao sintetizar a biblioteca de cDNA de comprimento total, esta tecnologia pode capturar diretamente a sequência completa do transcrito utilizando a sua capacidade de leitura super longa (o comprimento médio pode atingir 10-15 kb) sem depender do genoma de referência. A tecnologia Iso-Seq tem vantagens significativas na sequenciação de transcritos de comprimento total, tais como:

Alta Precisão na deteçãoO Iso-Seq destaca-se pela notável precisão na identificação de eventos de splicing, isoformas de transcritos, genes de fusão e RNAs não codificantes. Esta precisão proporciona aos investigadores uma visão mais detalhada e precisa do transcriptoma, permitindo uma compreensão mais profunda da função e regulação dos genes.

Cobertura Abrangente de TranscriçõesCobrir a transcrição completa desde a extremidade 5' até a extremidade 3', incluindo íntrons e a cauda poli-A, o que é útil para analisar a complexa estrutura do transcriptoma.

Versatilidade na aplicaçãoÉ adequado para sequenciação de transcriptoma de comprimento total de espécies sem genoma de referência e suporta a análise paralela de amostras de múltiplos tecidos.

Efeitos melhorados através da interfrataçãoA combinação com outras tecnologias de sequenciação (como RNA-seq) pode melhorar ainda mais a capacidade de análise dos dados do transcriptoma.

A PacBio é o principal promotor e líder da tecnologia Iso-Seq. A série Sequel II, a sua plataforma de sequenciação de terceira geração, melhorou significativamente a precisão e a consistência dos transcritos de comprimento completo através da tecnologia de sequenciação HiFi otimizada. A tecnologia Iso-Seq da PacBio é não só amplamente utilizada em investigação académica, mas também utilizada para anotação de genomas e análise de transcriptomas de plantas, animais e humanos.

Além disso, a PacBio desenvolveu uma variedade de ferramentas e software de apoio (como SMRT Link, IsoCon, TAMA, etc.) para nos fornecer uma solução completa desde a preparação da amostra até à análise de dados.

O que é Iso-Seq

A sequenciação de isoformas (Iso-Seq) é um método de sequenciação de transcritos de comprimento total baseado na tecnologia SMRT, que foi desenvolvida pela PacBio. Esta tecnologia tem como objetivo capturar e analisar as sequências completas de diferentes isoformas no genoma, proporcionando assim informações mais abrangentes sobre o transcriptoma. O seguinte descreve um princípio esquemático do Iso-Seq.

SMRT: SMRT é uma tecnologia de sequenciação de terceira geração, que realiza a sequenciação capturando modelos de DNA em um Guia de Onda de Modo Zero (ZMW). Este método não precisa interromper fragmentos de DNA, mas sequencia diretamente uma única molécula de DNA, permitindo o crescimento de uma sequência de leitura longa (geralmente 10 kb ou mais), e pode capturar completamente o transcrito de comprimento total desde a extremidade 5' até a extremidade poli-A.

Visão geral da tecnologia de sequenciação SMRT (Simon et al., 2018)

A tecnologia Iso-Seq pode gerar sequências de transcritos completos de alta qualidade ao sequenciar cDNA diretamente, sem interrupções ou splicing. Estas sequências incluem informações completas desde a extremidade 5' até a extremidade poli-A, o que permite aos investigadores analisar com precisão variantes de splicing, locais de iniciação, locais de terminação e eventos regulatórios pós-transcricionais, como splicing alternativo e poliadenilação (APA).

A tecnologia PacBio Iso-Seq é um método de sequenciação do transcriptoma de comprimento completo baseado em SMRT. A sua principal vantagem é que pode sequenciar transcritos de comprimento completo sem splicing ou inferência, proporcionando assim uma análise mais precisa da expressão génica e dos isómeros de transcritos. A tecnologia SMRT da PacBio é uma tecnologia de sequenciação de terceira geração, que gera sequências de leitura longas ao monitorizar o processo de síntese de DNA em tempo real. O seu componente central é a célula SMRT, que é um pequeno consumível contendo milhões de guias de onda em modo zero (ZMWs) para capturar moléculas de DNA e registar o processo de adição de nucleótidos em tempo real. Esta técnica pode gerar sequências com até 10 kb ou até mais, e a precisão é de até 99%.

A sequenciação PacBio é caracterizada pela sua alta precisão e capacidade de leitura longa. O seu comprimento médio de leitura varia geralmente entre 8-15 kb, podendo os mais longos atingir 40-70 kb. Este comprimento longo de leitura torna a PacBio especialmente adequada para estudar variantes de splicing e genes de fusão em regiões genómicas complexas, sequências repetitivas e no transcriptoma.

Vantagens do Iso-Seq

• Capacidade de leitura longa: O Iso-Seq pode gerar um segmento de leitura tão longo quanto 10kb ou até mais, o que lhe confere vantagens significativas na deteção de isómeros complexos e RNA não codificante longo (lncRNA) no genoma. Em contraste, as técnicas tradicionais de leitura curta e sequenciação longa (como o RNA-seq) não conseguem capturar completamente transcritos de comprimento total devido à limitação de fragmentação.
• Sequenciação direta de transcritos de comprimento total: A Iso-Seq pode gerar sequências de transcritos de comprimento total sem splicing ou montagem, o que simplifica bastante o processo de análise de dados e reduz os resultados falso positivos causados por erros de splicing. Este método é especialmente adequado para estudar a anotação do genoma, descobrir novos genes, detectar variantes de splicing e analisar eventos de splicing alternativo e poliadenilação.
• Reduzir a complexidade da montagem: Como o Iso-Seq pode gerar diretamente sequências completas de alta qualidade, não é necessário depender de algoritmos de splicing complexos para reconstruir a estrutura do transcrito. Isso não só melhora a precisão dos dados, mas também reduz a necessidade de recursos computacionais, permitindo que os investigadores analisem os dados do transcriptoma de forma mais eficiente.
• Em essência, o Iso-Seq representa um avanço poderoso na tecnologia de sequenciação de transcritos. Ao capturar e sequenciar diretamente cDNA de comprimento total, gera sequências de transcritos de alta qualidade e comprimento total sem interrupções ou emendas. A sua capacidade de leitura longa e a abordagem sem montagem oferecem vantagens significativas na anotação do genoma, descoberta de novos genes, deteção de variantes de emenda e na análise de eventos regulatórios pós-transcricionais.

Aplicações do Iso-Seq na Análise Genómica

Iso-Seq é uma ferramenta de bioinformática baseada na sequenciação de RNA de comprimento total, que é amplamente utilizada em muitos campos. A seguir estão aplicações específicas do Iso-Seq em diferentes áreas.

Descoberta e anotação de genes

Aprimoramento da anotação do genoma completo: O Iso-Seq pode gerar uma sequência de transcrito completa, o que é especialmente importante para novas espécies ou genomas sequenciados de forma incompleta. Ao comparar com o genoma de referência, o Iso-Seq pode localizar com precisão os limites dos exões, os locais de splicing e os locais de conexão de splicing alternativo, melhorando assim a precisão da anotação genética.

Descoberta de novos genes e isoformas: O Iso-Seq pode detetar muitos transcritos não comentados, incluindo novos genes, isómeros (como AS, APA) e genes de fusão. Isto fornece um abundante suporte de dados para a investigação genómica.

Elevar a qualidade da anotação: Comparado com as tradicionais tags de sequência de expressão (EST), RNA-Seq e métodos de inferência homóloga, o Iso-Seq pode anotar genes de forma mais precisa devido aos seus dados de sequência contínua.

Representação esquemática de AS e APA (An et al., 2018)

Pesquisa sobre splicing alternativo

Deteção de eventos de splicing alternativo (AS): O Iso-Seq pode detectar diretamente eventos de splicing alternativo, incluindo retenção de intrões, omissão de exões e deleção de exões. Estes dados são úteis para compreender o mecanismo de regulação da expressão génica.

Investigação da poliadenilação alternativa (APA): O Iso-Seq pode detetar eventos de APA em diferentes tecidos ou condições, e revelar o mecanismo de regulação pós-transcricional em diferentes tipos celulares ou estados fisiológicos.

Quantificação do splicing diferencial: Ao comparar os dados do transcriptoma de diferentes amostras, o Iso-Seq pode analisar quantitativamente os eventos de splicing diferencial e os seus efeitos funcionais, e fornecer apoio para o diagnóstico de doenças e desenvolvimento de biomarcadores.

Um exemplo de resultado de pesquisa sobre splicing alternativo (Nicola et al., 2014)

Análise do transcriptoma e isómeros

Simplificando a montagem e anotação do transcriptoma: Os dados de sequência de comprimento completo gerados pelo Iso-Seq evitam a complexidade da montagem do transcriptoma e melhoram a integridade do transcrito, refletindo assim de forma mais precisa o nível de expressão gênica e o mecanismo de regulação pós-transcricional.

Perfilando a expressão de isoformas: Usando dados de Iso-Seq, podemos analisar com precisão os padrões de expressão de diferentes isómeros, incluindo a expressão específica de tecidos e a resposta ao stress.

Avançando o estudo sobre RNA longo não codificante (lncRNA): Iso-Seq pode detectar e anotar lncRNA, o que fornece uma ferramenta importante para compreender o seu papel na regulação genética.

Atualização da anotação de referência da alface por HIT-ISOseq (Shi et al., 2024)

Genómica comparativa

Descobrindo diferenças entre espécies: Ao comparar os dados de Iso-Seq de diferentes espécies, podem ser revelados padrões de expressão génica específicos de cada espécie e mecanismos de regulação pós-transcricional. Por exemplo, estudos demonstraram que o Iso-Seq pode encontrar transcritos únicos e isómeros de splicing ao comparar diferentes espécies de plantas.

Rastreando mudanças evolutivas: Os dados de Iso-Seq são úteis para analisar as mudanças na estrutura e função do genoma durante a evolução das espécies, especialmente na ausência de um genoma de referência.

Como uma tecnologia avançada de sequenciamento de RNA, o Iso-Seq tem um amplo potencial de aplicação. Não só pode melhorar a precisão e a completude da anotação genética, mas também estudar profundamente as funções do splicing alternativo, isómeros do transcriptoma e RNA longo não codificante. Além disso, o Iso-Seq também demonstra um grande potencial em genómica comparativa e pesquisa evolutiva. No entanto, devido ao alto custo, a sua aplicação em larga escala ainda enfrenta certos desafios.

Para informações mais detalhadas, consulte os artigos:

• Aplicações do Iso-Seq na Pesquisa em Genómica e Transcriptómica
• O Poder do Iso-Seq na Descoberta e Anotação de Genes

Protocolo Básico de Iso-Seq

Iso-seq, nomeadamente sequenciação de transcritos de comprimento total, é um método de sequenciação baseado na tecnologia de sequenciação em tempo real de moléculas únicas da PacBio, e o seu fluxo inclui principalmente os seguintes elos chave:

Preparação de amostras

Extração de RNA e garantia de qualidade: A extração de RNA é um passo fundamental na sequenciação do transcriptoma. Normalmente, são utilizados métodos específicos para separar as moléculas de RNA das amostras e remover impurezas desnecessárias. Por exemplo, a digestão com DNase I é utilizada para remover a contaminação por DNA, e depois o RNA é purificado adicionalmente por esferas magnéticas. O RNA extraído necessita de controlo de qualidade, incluindo o uso de Qubit ou Agilent Bioanalyzer para detectar a concentração e integridade do RNA.

Síntese de cDNA: Transcrição reversa de RNA em cDNA (DNA complementar) para análise subsequente. Métodos comumente utilizados incluem o uso do kit de síntese de cDNA SMARTer Total RNA-Seq, que pode transcrever reversamente RNA no final do poli(A) em cDNA. No processo de síntese de cDNA, um adaptador especial é geralmente adicionado para a amplificação subsequente por PCR e construção de bibliotecas.

Etapas da preparação da biblioteca Iso-Seq (Marta et al., 2020)

Sequenciação e geração de dados

Preparação de bibliotecas PacBio: A biblioteca é preparada ligando fragmentos de cDNA a vetores adequados para sequenciação. Por exemplo, uma biblioteca foi preparada utilizando o template do ligador SMARTer P5/P7 e amplificada pelo sistema KAPA HiFi HotStart PCR. A biblioteca amplificada necessita de triagem de qualidade para garantir que é adequada para sequenciação. Por exemplo, a concentração da biblioteca foi determinada utilizando o ensaio Qubit BR DNA HS, e o tamanho foi selecionado por E-gel.

Operação de sequenciação e recolha de dados: A plataforma de sequenciação PacBio Sequel II foi utilizada para sequenciação. Durante a sequenciação, múltiplas células SMRT podem ser usadas para sequenciação paralela, a fim de melhorar a cobertura dos dados. Após a conclusão da sequenciação, os Subreads gerados precisam de ser controlados quanto à qualidade e aparados para remover fragmentos de sequência de baixa qualidade ou erróneos.

Processo de análise de dados

Pré-processamento de dados: O controlo de qualidade foi realizado nos dados de sequenciação originais para remover segmentos de leitura de baixa qualidade e sequências de ligadura. Utilize ferramentas como Trimmomatic ou Cutadapt para aparar os dados e garantir a qualidade dos dados.

Identificação e anotação de transcritos de comprimento completo: Utilizando a tecnologia Iso-Seq da PacBio, os dados são unidos e anotados pelo software SMRT Analysis (como a análise SMRT) para gerar transcritos de comprimento completo (incluindo as regiões UTR 5' e 3'). A estrutura e a função dos transcritos foram analisadas mais detalhadamente através da comparação com genomas de referência ou utilizando o método de montagem de novo.

Análise de dados a montante: a análise inclui análise de expressão diferencial, deteção de eventos de splicing alternativo e análise de locais de iniciação de transcrição. Por exemplo, utilizar ferramentas como DESeq2 e EdgeR para realizar a análise de expressão diferencial. Os resultados de visualização podem ser apresentados através de mapas de vulcão, mapas térmicos e outros métodos para ajudar os investigadores a compreender as diferenças na expressão génica sob diferentes condições.

Pipelines de processamento e análise de dados para dados de RNA-seq e dados de Iso-Seq (Jiang et al., 2017)

Com base nos passos acima, o protocolo completo de Iso-Seq inclui preparação de amostras, preparação de bibliotecas, operação de sequenciação e análise de dados. Este processo pode gerar dados de transcritos de comprimento total de alta qualidade e fornecer suporte informativo abrangente para a pesquisa do transcriptoma.

Para informações mais detalhadas, consulte o artigo:

• Guia Passo a Passo para o Protocolo Iso-Seq: Desde a Preparação da Amostra até à Análise de Dados

Conclusão

O Iso-Seq é um método de sequenciação de transcritos de comprimento completo baseado na tecnologia de sequenciação de terceira geração, que foi desenvolvido pela PacBio. Ao fornecer uma sequência completa de cDNA, evita a etapa de reconstrução do transcriptoma na sequenciação de RNA tradicional (como RNA-seq), melhorando assim a precisão e a completude da anotação de transcritos. O Iso-Seq pode gerar um segmento de leitura de comprimento total não repetitivo (FLNC) de até 10 kb, cobrindo todas as regiões desde o cap 5' até a cauda de poliadenilação, o que representa uma vantagem significativa na revelação da complexidade do transcriptoma.

No entanto, o Iso-Seq também tem algumas limitações, como custos mais elevados e menor rendimento. No entanto, com o progresso da tecnologia e a redução de custos, espera-se que o Iso-Seq se torne uma ferramenta importante para a investigação do transcriptoma.

No futuro, o desenvolvimento da tecnologia Iso-Seq terá um impacto profundo na investigação genómica. A seguir, estão várias direções de desenvolvimento possíveis e os seus potenciais impactos:

Integração de múltiplas tecnologias de sequenciação: Combinando leituras curtas e tecnologias de sequenciação longa (tais como RNA-seq e Iso-seq) ajudarão a superar as suas respetivas limitações técnicas. Por exemplo, ao integrar dados de RNA-seq de leitura curta e dados de Iso-seq de leitura longa, os investigadores podem analisar de forma mais abrangente a complexidade do transcriptoma e melhorar a precisão da anotação genética.

Aplicação a mais espécies: Com a popularização da tecnologia Iso-Seq, a sua aplicação em espécies não modelo será mais extensa. Por exemplo, na investigação de organismos marinhos, insetos e plantas, a tecnologia Iso-Seq ajudará a revelar as características genómicas únicas e o mecanismo evolutivo dessas espécies.

Apoiar a medicina personalizada: Com o aprofundamento da investigação em genómica, a tecnologia Iso-Seq pode desempenhar um papel importante na medicina personalizada. Por exemplo, ao analisar os dados do transcriptoma de um indivíduo, pode ser fornecido um esquema mais personalizado para um diagnóstico e tratamento precisos.

A tecnologia Iso-Seq está a tornar-se cada vez mais importante na investigação do transcriptoma, e o seu desenvolvimento futuro irá promover significativamente o progresso da investigação genómica e trazer novas oportunidades para a biologia, medicina e outros campos.

Referências:

1. An Dong, Hieu X. Cao, Li Changsheng, Klaus Humbeck e Wang Wenqin. "Sequenciação de Isoformas e Aplicações de Ponta para Desvendar a Complexidade dos Transciptomas Vegetais." Genes (2018): 9. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça o conteúdo que deseja traduzir.
2. Nicola Vitulo, Claudio Forcato, Elisa Corteggiani Carpinelli, Andrea Telatin, Davide Campagna e Michela D'Angelo. "Um estudo aprofundado do splicing alternativo na videira revela alterações na maquinaria de splicing relacionadas com o tecido, condição de stress e genótipo." BMC Biologia de Plantas (2014) 14:99. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça o texto que deseja traduzir.
3. Shi Zhouxing, Luo Bei, Zhao Haiming, Yang Langqi, Chen Zhichao e Pu Yuqing. "Análise de sequenciação de RNA de leitura longa de moléculas únicas de alto rendimento de genes e isoformas específicos de tecido na alface (Lactuca sativa L.)." Biologia das Comunicações (2024) 7: 920. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e terei o prazer de ajudar com a tradução.
4. Gao Yubang, Xi Feihu, Zhang Huangxiao, Liu Xuqing, Wang Huiyuan, Zhao Liangzhen, Anierddy S.N. Reddy e Gu Lianfeng. "Sequenciação de Isoformas em Tempo Real de Molécula Única (SMRT) em Plantas: O Estado das Ferramentas de Bioinformática para Desvendar a Complexidade do Transcritoma." Bioinformática Atual (2019): 1-8. DOI: 10.2174/1574893614666190204151746
5. Simon Ardui, Adam Ameur, Joris R. Vermeesch e Matthew S. Hestand. "Sequenciação em tempo real de molécula única (SMRT) atinge a maioridade: aplicações e utilidades para diagnósticos médicos." Pesquisa em Ácidos Nucleicos (2018): 2159-2168. doi: 10.1093/nar/gky066
6. Marta Puchta, Maja Boczkowska e Jolanta Groszyk. "Baixo Valor de RIN para a Construção de Bibliotecas de RNA-Seq a partir de Sementes Armazenadas a Longo Prazo: Um Estudo de Caso de Sementes de Cevada." Genes (2020): 11, 1190. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e eu farei a tradução.
7. X. Jiang, A.B. Hall, J.K. Biedler e Z Tu. "A sequenciação de RNA de molécula única revela trans-splicing e melhora as anotações em Anopheles stephensi." Biologia Molecular de Insetos (2017): 298-307. doi: 10.1111/imb.12294
8. Li Hongna, Shams ur Rehman, Song Rui, Qiao Liang, Hao Xiaohua e Chen Shisheng. "Montagem e anotação em escala de cromossoma do parente do trigo selvagem Aegilops comosa." Dados Científicos (2014) 11: 1454. Desculpe, não posso acessar links. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, cole-o aqui e eu farei a tradução.