Um Guia Abrangente de Genomas Montados a Partir de Metagenomas

A chegada dos genomas montados a partir de metagenomas (MAGs) transformou a genómica microbiana, uma vez que permite a reconstrução específica de genomas individuais a partir de dados metagenómicos. Os MAGs dão acesso a organismos microbianos não cultivados que podem ser recursos potenciais, destacando que esta prática é capaz de explorar uma infinidade de formas de vida não atribuídas que não podem ser cultivadas por métodos de cultura tradicionais. Esta abordagem permitiu o estudo de ecossistemas complexos como o solo, os oceanos e o microbioma humano - onde milhares de espécies vivem e interagem.

Os MAGs são gerados a partir de conjuntos de dados metagenómicos ao montar leituras curtas ou longas disponíveis utilizando tecnologias comumente usadas, permitindo sequenciação em alta capacidade, e organizando contigs em unidades a nível de genoma através de abordagens computacionais. Estes genomas são extremamente úteis para decifrar o potencial metabólico, a função ecológica e as relações evolutivas dos microrganismos em ecossistemas geridos e naturais. E à medida que a sequenciação se torna cada vez mais acessível e económica, os MAGs estão a provar ser uma ferramenta essencial para decifrar a vida microbiana. Estes servem de base para separar interacções microbianas complicadas, identificar novas vias e explorar as capacidades funcionais das comunidades microbianas. Este poder revolucionário de examinar genomas sem processos de cultivo tem consequências de longo alcance para a biologia ambiental, a saúde humana e usos industriais.

Os MAGs adicionais ajudam a resolver o problema da "matéria escura microbiana", uma vez que reconstituem genomas de espécies de organismos que não foram cultivadas em laboratório. Estas descobertas também elucidaram processos ecológicos e evolutivos, destacando novas linhagens microbianas e vias metabólicas. A resolução de genomas de comunidades microbianas mistas também permitiu que os investigadores aprendessem mais sobre relações simbióticas e competição entre microrganismos. Aqui, apresentamos uma revisão integrada sobre os MAGs com o objetivo de fornecer uma breve introdução para a compreensão e aplicação dos MAGs.

O que é a Reconstrução MAG

A reconstrução MAG refere-se à montagem de dados metagenómicos em fragmentos de genoma. No entanto, devido à complexidade e heterogeneidade das comunidades microbianas, este processo é ainda mais complicado.

• Sequenciação MetagenómicaEm sequenciação metagenómica, toda a sequência de material genético de uma amostra é sequenciada. Este método caracteriza a diversidade genómica de comunidades microbianas completas, abrangendo bactérias, arqueias, vírus e eucariotas. Como a metagenómica não isola organismos individuais, reflete uma visão mais holística do panorama genético do ecossistema.
• Montagem e AgrupamentoA montagem metagenómica refere-se à construção de sequências contíguas (contigs) a partir de leituras de sequenciamento brutas. Estes contigs são posteriormente alocados em bins baseados em sequência e cobertura que refletem genomas em rascunho de espécies individuais. No caso de dados de sequenciamento metagenómico shotgun misto, a binagem é vital para extrair material genético dos organismos individuais que participaram no experimento, particularmente em ambientes microbianos hiper-diversos.
• Avaliação da QualidadeEstas métricas incluem completude, contaminação e fragmentação do genoma para avaliar a qualidade dos MAGs. MAGs de boa qualidade são pelo menos 90% completos com menos de 5% de contaminação, tornando-os úteis para análises funcionais e estudos comparativos. Estas métricas são avaliadas por software como CheckM e BUSCO, que realizam a indexação da recuperação de ortólogos de cópia única e níveis de contaminação genómica.

Esquema de análise de metagenoma (Goussarov, G. et al. 2022).

Desafios Atuais

• Complexidade da ComunidadeExistem milhares de espécies com diferentes abundâncias numa comunidade microbiana, tornando a montagem e a classificação desafiadoras. A recuperação do genoma é tendenciosa em relação a espécies de alta abundância, levando a que organismos de baixa abundância estejam sub-representados nos dados. Isto exige uma otimização cuidadosa das estratégias de amostragem e da profundidade de sequenciação.
• Elementos RepetitivosElementos repetidos dentro e entre genomas complicam a montagem adequada de contigs. Elementos transponíveis ou operões conservados, por exemplo, introduzem ambiguidades no mapeamento de leituras e na ligação de contigs. Algoritmos como Flye e Canu, que combinam dados de sequenciação de leituras longas, têm funcionado bem para resolver estas regiões.
• ContaminaçãoA presença de artefatos de sequenciação e sinal sobreposto de espécies estreitamente relacionadas pode introduzir contaminação em MAGs altamente semelhantes. Isto prejudica ainda mais as anotações funcionais e as análises subsequentes. Estes grupos podem ser refinados utilizando ferramentas adicionais como o MetaWRAP, que remove ainda mais contaminantes e refina os grupos genómicos.
• Requisitos ComputacionaisA vasta natureza dimensional dos conjuntos de dados metagenómicos exige recursos computacionais de alta dimensão para montagem, agrupamento e refinamento. Conjuntos de dados com biliões de leituras necessitam de sistemas de alta memória e processos paralelos para serem geridos. O uso cada vez mais prevalente de soluções de computação em nuvem e pipelines otimizados está a tornar possível a escalabilidade da reconstrução de MAG.

Tecnologias e Metodologias Computacionais

O sucesso da reconstrução de MAG tem sido impulsionado por inovações em hardware e algoritmos em constante evolução. Com plataformas de sequenciação específicas e software de análise de dados, todos estes elementos contribuem para a geração de MAGs de alta qualidade.

Plataformas de Sequenciamento

Ferramentas emergentes têm fornecido estratégias para abordar os problemas nos MAGs. Por exemplo, a sequenciação da Illumina tem sido aplicada em estudos metagenómicos devido ao seu custo mais baixo e escalabilidade atualmente. No entanto, as suas leituras curtas tendem a não ter um bom desempenho em regiões altamente repetitivas.

• Sequenciação de Longa Leitura (PacBio e Nanopore)Produzir leituras que podem estender-se por dezenas de quilobases, crítico para cobrir regiões repetitivas e melhorar a montagem de genomas complexos. As leituras PacBio HiFi, por exemplo, oferecem comprimentos de leitura longos enquanto proporcionam alta precisão, permitindo melhorias tanto na continuidade como na correção nas montagens.
• Abordagens HíbridasA fusão de leituras curtas e longas maximiza a precisão e continuidade das montagens, especialmente em comunidades microbianas complexas. Abordagens híbridas tiram partido das capacidades de correção de erros das leituras curtas e da informação estrutural oferecida pelas leituras longas. O MaSuRCA e o SPAdes são ferramentas comumente utilizadas para isso.

Ferramentas de Montagem

• MEGAHIT e MetaSPAdes: Adaptado para dados metagenómicos; faz um bom trabalho com conjuntos de dados de leituras curtas. O MEGAHIT foi concebido para conjuntos de dados ultra-grandes, enquanto o MetaSPAdes oferece correção de erros e uma estrutura de construção de grafos iterativa para montagem metagenómica.
• Flye e CanuFerramentas especializadas de montagem de leituras longas que podem ser úteis em metagenomas de baixa complexidade para construir sequências contíguas. O Flye consegue lidar com leituras longas ruidosas, portanto, trabalha com dados de Nanopore, enquanto o Canu lida com montagens de PacBio.

Algoritmos de Agrupamento

• Métodos baseados em composição: MetaBAT e CONCOCT são exemplos de ferramentas baseadas em composição que agrupam contigs com base em métricas de composição de sequência, incluindo conteúdo de GC e frequências de tetranucleotídeos. Estes métodos apresentam um bom desempenho na distinção de genomas em comunidades de diversidade intermédia.
• Métodos baseados em cobertura: Ferramentas como o MaxBin exploram a cobertura diferencial em cada amostra para melhorar a precisão da binagem. Ao analisar as diferenças de cobertura, estas ferramentas conseguem distinguir genomas com composições de sequência idênticas.
• Métodos Híbridos: Alguns algoritmos, como a ferramenta DAS, combinam diferentes métodos de agrupamento para otimizar e melhorar a qualidade dos agrupamentos genómicos. Esta combinação proporciona uma maior recuperação e precisão na identificação de agrupamentos genómicos, em conjuntos de dados altamente diversos.

Ferramentas de Refinamento

• CheckM: Avaliar a completude e contaminação para avaliar a qualidade dos MAGs. É valioso para monitorizar a utilidade dos MAGs em análises posteriores.
• Ferramentas de montagem: MetaWRAP e Anvi'o têm fluxos de trabalho para a re-montagem e refinamento de MAGs para melhorar a precisão e a usabilidade. Com base nisso, estas ferramentas permitem a visualização e exploração aprofundada de dados metagenómicos, permitindo uma melhor interpretação dos resultados.

Aplicação para Genomas Montados a Partir de Metagenomas

Desde a ciência ambiental até à medicina, os MAGs têm aplicações transformadoras em várias disciplinas. Eles são a chave para revelar tanto a diversidade microbiana não cultivada como para clarificar as funções microbianas, e desempenham um papel como uma abertura para o futuro caminho evolutivo do nosso planeta.

Microbiologia Ambiental

Os MAGs permitem a investigação de assemblagens microbianas em vários ambientes, incluindo solo, marinho e habitats extremos. Os investigadores entrelaçaram genomas a partir dos dados e mapearam vias metabólicas que aproveitam o ciclo de nutrientes, a sequestro de carbono e a degradação de poluentes. Assim, os MAGs de amostras ambientais, como sedimentos de fundo marinho, podem fornecer novas percepções sobre a base genética de processos biogeoquímicos, como o metabolismo do metano e a degradação de hidrocarbonetos. Essas percepções podem informar os ciclos biogeoquímicos e os processos biotecnológicos.

Estudos do Microbioma Humano

Na saúde humana, os MAGs oferecem informações sobre a estrutura e função do microbioma humano. Eles desempenharam um papel crucial na descoberta de espécies microbianas ligadas a distúrbios como a doença inflamatória intestinal, obesidade e câncer. Os MAGs também revelam genes funcionais do metabolismo de fármacos e resistência, preparando o terreno para a medicina personalizada. Um exemplo seriam as análises derivadas de MAGs dos microbiomas intestinais, detectando vias associadas à modulação imunológica do hospedeiro e distúrbios metabólicos.

Biotecnologia Industrial

Os MAGs melhoram o estudo de enzimas e vias relevantes para a indústria. Um exemplo é a utilização de enzimas identificadas em MAGs envolvidas na degradação da lignocelulose para a produção de biocombustíveis. A mineração genómica de MAGs também levou à descoberta de novos compostos antimicrobianos e metabolitos secundários. Estas aplicações destacam o papel promissor dos MAGs na resolução de grandes questões globais, como a energia sustentável e a resistência a antibióticos.

Ligando Perspectivas Evolutivas e Ecológicas

Os MAGs fornecem informações sobre a história evolutiva e os papéis ecológicos dos microrganismos. Usando genómica comparativa de MAGs, será possível traçar as origens evolutivas de características, como resistência a antibióticos ou relações simbióticas. Os MAGs também mantêm a capacidade de fornecer informações sobre interações microbianas e especialização de nicho, essenciais para uma compreensão holística das comunidades em que se encontram. Análises de MAGs derivados de microbiomas de recifes de coral, por exemplo, sugeriram papéis dos micróbios na saúde dos corais e nas respostas ao stress.

Direcções e Inovações no Futuro

As tecnologias e metodologias emergentes no campo de investigação MAG já sugeriram formas de ultrapassar as limitações atuais e alargar o âmbito das aplicações.

Desenvolvimentos em Técnicas de Sequenciação

Algoritmos de chamada de base melhorados e o uso de sequenciação de leituras ultra-longas aumentarão tanto a resolução quanto a completude dos MAGs. Além disso, esses avanços permitirão agora a reconstrução de genomas mais difíceis e maiores, como os de micróbios eucarióticos. A continuação da redução de custos na sequenciação, sem uma diminuição na qualidade dos dados, aumentará o acesso à reconstrução de MAG.

Integração de Dados Multi-ómicos Baseada em Modelo de Água

A integração da metagenómica com a transcriptómica, proteómica e metabolómica oferece uma perspetiva mais holística sobre as comunidades microbianas. A integração de multi-ómi cas permite a associação de genomas montados a partir de metagenomas (MAGs) com características funcionais e fenotípicas, proporcionando insights sobre a função dos micróbios em sistemas ecológicos. Este quadro pode ser especialmente útil para interpretar as respostas microbianas a alterações ambientais e os seus papéis funcionais na geração de estabilidade dos ecossistemas.

IA e Aprendizagem Automática

Uso de algoritmos de aprendizagem automática para melhorar a montagem, agrupamento e anotação metagenómica. Estas ferramentas melhoram a precisão da reconstrução do genoma e minimizam os estrangulamentos computacionais, agilizando assim a identificação de novos genomas e genes. Abordagens de agrupamento baseadas em IA mostraram potencial para revelar padrões complexos presentes nestes conjuntos de dados, levando a uma recuperação aprimorada de MAG de alta qualidade a partir de ambientes mais complicados.

Observatórios e Bases de Dados Internacionais

Grandes quantidades de dados metagenómicos estão a ser gerados por projetos como o Projeto Microbioma da Terra e o Projeto Microbioma Humano. Fluxos de trabalho padronizados e bases de dados de acesso aberto são necessários para facilitar a utilidade dos MAGs. Estas iniciativas facilitam a colaboração global e o compartilhamento de dados, acelerando as descobertas em genómica e ecologia microbiana.

Estudo de Caso: Reconstrução de MAGs do Microbioma Intestinal Humano

Fundo

O microbioma intestinal humano é um ecossistema microbiano complexo com impactos profundos na saúde e na doença humanas. Apesar da sua importância, uma proporção substancial da sua diversidade microbiana permanece não cultivada e mal caracterizada. Os investigadores pretendiam reconstruir uma alta qualidade. MAGs a partir de metagenomas intestinais humanos para compreender melhor a composição, o potencial metabólico e os papéis funcionais destes micróbios.

Métodos

• Coleta de Amostras e SequenciaçãoForam recolhidas amostras fecais de diversas populações humanas para capturar uma ampla representação da diversidade microbiana intestinal. Sequenciação metagenómica foi realizado utilizando tecnologia Illumina para leituras curtas de alta profundidade e complementado com Oxford Nanopore para leituras longas para resolver regiões complexas.
• Montagem e AgrupamentoAs leituras metagenómicas foram montadas usando o MEGAHIT para montagem de leituras curtas e o Flye para integração de leituras longas. A binagem do genoma foi realizada utilizando uma combinação do MetaBAT2 e do MaxBin, aproveitando a composição da sequência e a cobertura diferencial entre amostras para separar genomas individuais.
• Avaliação e Refinamento da QualidadeO CheckM foi utilizado para avaliar a completude e contaminação dos MAGs. Foram retidos binários de alta qualidade (>90% de completude, <5% de contaminação), e foi realizada uma refinamento manual utilizando o Anvi'o. As anotações funcionais foram realizadas com Prokka e mapeamento da base de dados KEGG.

Resultados

• Recuperação de Genomas Novos: Mais de 100.000 MAGs foram reconstruídos, incluindo milhares de genomas bacterianos e arqueais novos. Uma parte significativa destes representava táxons microbianos previamente não cultivados.
• Insights Funcionais: Foram identificados caminhos metabólicos chave, incluindo aqueles envolvidos na degradação de fibras, produção de ácidos gordos de cadeia curta e biossíntese de aminoácidos. O estudo também revelou genes microbianos ligados ao metabolismo de fármacos e resistência, destacando o papel do microbioma na modulação da eficácia terapêutica.
• Análise em Nível Populacional: Análises comparativas revelaram diferenças na composição microbiana entre populações, elucidando o impacto da dieta, geografia e estilo de vida na diversidade da microbiota intestinal.

Mapas genómicos de quatro MAGs completos montados (circularizados, sem lacunas) (CMAGs) (Jin, H. et al 2021).

Conclusão

Os MAGs abriram a porta à genómica microbiana da maioria não cultivada da vida. Os MAGs permitem uma visão sem precedentes sobre a diversidade microbiana, ecologia e função ao recuperar genomas diretamente de amostras ambientais. Embora a montagem e a classificação não estejam isentas de desafios, as abordagens e ferramentas de Montagem de Genomas estão em constante evolução para fornecer MAGs de maior qualidade e mais acessíveis. Neste panorama em evolução, os MAGs tornar-se-ão cada vez mais cruciais na resolução de problemas globais, como os relacionados com a sustentabilidade ambiental e a saúde humana, estabelecendo a sua posição na era genómica.

Referências:

1. Goussarov, G., Mysara, M., Vandamme, P., & Van Houdt, R. (2022). Introdução aos princípios e métodos subjacentes à recuperação de genomas montados a partir de dados metagenómicos. MicrobiologiaAberta, 11(3), e1298. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e terei prazer em traduzi-lo.
2. Jin, H., You, L., Zhao, F., Li, S., Ma, T., Kwok, L. Y., Xu, H., & Sun, Z. (2022). Sequenciação metagenómica híbrida e ultra-profunda permite a caracterização genómica e funcional de espécies de baixa abundância no microbioma intestinal humano. Micróbios intestinais, 14(1), 2021790. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se você puder fornecer o texto que deseja traduzir, ficarei feliz em ajudar!