Diretrizes para Submissão de Amostras
Sequenciação de rRNA 16S vs. Sequenciação de Metagenoma: Um Guia para Seleção
A investigação sobre o microbioma revolucionou a nossa compreensão das complexas comunidades microbianas, e duas técnicas fundamentais na vanguarda desta exploração são o sequenciamento de 16S rRNA e o sequenciamento de metagenoma. Estas metodologias, cada uma com forças e aplicações únicas, permitem que os cientistas desvendem as complexidades dos ecossistemas microbianos. Neste artigo, aprofundamo-nos nas intricacias destas técnicas e fornecemos um guia detalhado para ajudar os investigadores a navegar na escolha entre o sequenciamento de 16S rRNA e o sequenciamento de metagenoma com base nos seus objetivos de investigação específicos.
Visão geral dos métodos de NGS do gene 16S rRNA e metagenómica shotgun. (Boers et al., 2019)
Sequenciamento de 16S rRNA
A técnica de sequenciamento de DNA ribossómico 16S (rRNA) tem como alvo um segmento dentro da subunidade pequena dos ribossomas procarióticos, variando de 1300 a 1600 pares de bases de comprimento. Esta região contém 10 regiões conservadas que refletem a afinidade evolutiva entre espécies biológicas, juntamente com 9 regiões altamente variáveis que destacam as diferenças entre espécies. As regiões conservadas atuam como uma base para a identificação taxonómica, enquanto as regiões variáveis encapsulam distinções únicas entre as espécies. Normalmente, a amplificação por PCR de uma região altamente variável (como V4 ou V3-V4) ou do comprimento total da sequência de 16S rRNA é seguida pelo sequenciamento.
Por favor, consulte o nosso artigo Princípios e Fluxo de Trabalho do Sequenciamento de Amplicons de 16S/18S/ITS.
Sequenciamento de Metagenoma
O sequenciamento de metagenoma transcende as fronteiras das sequências individuais de 16S rRNA, abrangendo todo o material genético dentro de uma amostra, incluindo DNA do hospedeiro e genomas microbianos. Esta abordagem abrangente concede insights tanto sobre a composição taxonómica quanto sobre o potencial funcional. Através do sequenciamento de DNA ambiental de alto rendimento, o sequenciamento de metagenoma facilita análises que abrangem a estrutura da comunidade microbiana, conteúdo genético e vias funcionais.
Pode estar interessado no nosso artigo Introdução à Metagenómica Shotgun, da Amostragem à Análise de Dados.
Fatores que Influenciam a Decisão
- Objetivos de Investigação
A articulação de objetivos de investigação precisos tem uma importância extrema. Quando a intenção gira em torno de decifrar aspectos como composição de espécies, diversidade e abundância relativa, a aplicação do sequenciamento de 16S rRNA torna-se uma escolha judiciosa. Em cenários onde as investigações se aprofundam em aspectos granulares como funções específicas, conteúdo genético e vias intricadas, o sequenciamento de metagenoma emerge como a abordagem preferida e mais apropriada.
- Resolução Taxonómica
O sequenciamento de 16S rRNA destaca-se por fornecer uma maior precisão taxonómica, frequentemente estendendo-se até os níveis de gênero ou espécie. Em contraste, o sequenciamento de metagenoma oferece uma precisão superior, permitindo discernir diferenças subtis ao nível da cepa e, notavelmente, a potencial reconstrução de genomas completos.
- Custo e Rendimento
É imperativo levar em conta as restrições financeiras. O sequenciamento de 16S rRNA oferece uma solução economicamente viável e de alto rendimento, tornando-se particularmente vantajoso ao lidar com grandes esforços de perfilagem comunitária. Por outro lado, o sequenciamento de metagenoma implica custos mais elevados devido ao volume considerável de dados gerados e aos requisitos computacionais associados.
- Complexidade da Amostra
Quando se trabalha com amostras que contêm um conjunto bem definido de microrganismos conhecidos, o sequenciamento de 16S rRNA revela-se adequado e apropriado. Em contrapartida, o sequenciamento de metagenoma realmente brilha quando confrontado com a exploração de amostras intricadas e diversas que abrigam espécies novas ou mal caracterizadas.
- Insights Funcionais
O sequenciamento de metagenoma capacita os investigadores com a capacidade de desvendar insights funcionais intricados. Isso inclui a capacidade de prever vias metabólicas e identificar potenciais papéis funcionais. Tais revelações têm um valor imenso, especialmente para estudos que atravessam os domínios da ecologia, medicina e biotecnologia.
Sequenciamento de 16S rRNA vs. Sequenciamento Metagenómico
| Fatores | Sequenciamento de 16S rRNA | Sequenciamento Metagenómico |
| Preparação da Amostra | Complexidade semelhante ao sequenciamento shotgun | Igualmente intrincada como o sequenciamento de 16S rRNA |
| Perfilagem Funcional (Genes Microbianos) | Potencial para perfilagem funcional predita | Oferece uma visão extensa do potencial funcional, embora não seja definitivamente conclusiva |
| Resolução Taxonómica | Gênero (potencialmente espécie); influenciado pelas regiões alvo | Espécies bacterianas (e possivelmente cepas e variantes de nucleotídeos únicos com profundidade de sequenciamento suficiente) |
| Cobertura Taxonómica | Abraça bactérias e arqueias | Envolve todos os táxons, incluindo vírus |
| Requisitos de Bioinformática | Adequado para aqueles com experiência de iniciante a intermediário | Exige proficiência de intermediário a avançado |
| Bancos de Dados | Baseia-se em bancos de dados estabelecidos e meticulosamente curados | Depende de bancos de dados relativamente novos e em evolução |
| Sensibilidade à Contaminação por DNA do Hospedeiro | Impacto mínimo (o sucesso da PCR depende da presença do microbioma e da ausência de inibidores) | Altamente sensível; sujeito a variação pelo tipo de amostra (ajustável adaptando a profundidade de sequenciamento) |
| Viés | Moderado a alto (a composição taxonómica é influenciada pelos primers escolhidos e pela região variável) | Menos pronunciado (embora imparcial, viéses potenciais podem surgir durante as fases experimental e analítica) |
A combinação de ambas as metodologias pode gerar insights abrangentes. Utilize o sequenciamento de 16S rRNA para perfilagem taxonómica e avaliação inicial da comunidade, e posteriormente empregue o sequenciamento de metagenoma para desvendar o potencial funcional e nuances taxonómicas mais finas.
Conclusão
- Restrições de Custo: Opte pelo sequenciamento de 16S rRNA quando o orçamento for limitado.
- Foco da Investigação: Para composição e diversidade de espécies, o sequenciamento de 16S rRNA é suficiente. O sequenciamento de metagenoma é essencial para investigações funcionais e a nível de genes.
- Aquisição de Genomas: O sequenciamento de metagenoma oferece insights a nível de genoma, mesmo para bactérias não cultivadas.
- Abordagem Híbrida: Combine o sequenciamento de 16S rRNA com o sequenciamento de metagenoma para estudos a nível de espécies custo-efetivos juntamente com uma análise funcional mais profunda.
- Contaminação por Hospedeiro: Escolha o sequenciamento de 16S rRNA para amostras com potencial de contaminação por DNA de hospedeiros eucarióticos.
Estudos de Caso
Estudo de Caso 1 - Explorando o Microbioma Bacteriano do Solo Amazónico
Neste estudo ilustrativo, o alvo gira em torno da análise do intrincado microbioma bacteriano presente no solo amazónico. Dadas as circunstâncias elaboradas anteriormente, onde certos táxons podem ser raros ou inadequadamente estudados, optar por bancos de dados bacterianos de 16S rRNA revela-se vantajoso. Esta escolha decorre da falta de genomas de referência completos prontamente disponíveis para estas espécies específicas. Assim, tirar partido do sequenciamento de 16S rRNA ofereceria uma resolução taxonómica aprimorada em comparação com o sequenciamento de metagenoma, que se alinha adequadamente com os objetivos do estudo.
Estudo de Caso 2 - Acompanhamento das Alterações do Microbioma e Presença de Genes Antimicrobianos Após Transplante Fecal
A vantagem saliente do sequenciamento de metagenoma reside na sua capacidade de fornecer insights multifacetados sobre o microbioma funcional, abrangendo dados sobre genes microbianos. Para o cenário delineado aqui, um estudo destinado a decifrar as mudanças na composição do microbioma e a presença de genes antimicrobianos após um transplante fecal, o sequenciamento de metagenoma emerge como a escolha preferida. Ao adotar o sequenciamento de metagenoma, a investigação pode capturar efetivamente as alterações na composição do microbioma intestinal e, simultaneamente, aprofundar-se na perfilagem abrangente dos genes de resistência antimicrobiana juntamente com os seus hospedeiros associados.
Estudo de Caso 3 - Dinâmicas Diárias do Microbioma Intestinal Após Intervenção de Fibra Dietética de 2 Semanas
No contexto do estudo das oscilações diárias no microbioma intestinal devido a uma intervenção de fibra dietética de 2 semanas, surgem certas instâncias em que as modificações se manifestam predominantemente a nível funcional. Em tal cenário de estudo, uma seleção judiciosa seria o sequenciamento shotgun raso. Esta abordagem capacita de forma única a avaliação tanto das variações composicionais (como mudanças de espécies ou cepas) quanto das disparidades funcionais dentro do microbioma intestinal resultantes da intervenção dietética. Notavelmente, este método estende esses benefícios analíticos a um custo comparável ao do sequenciamento de 16S rRNA.
Referência:
- Boers, Stefan A., Ruud Jansen, e John P. Hays. "Compreender e superar as armadilhas e viéses dos métodos de sequenciamento de nova geração (NGS) para uso no laboratório de diagnóstico microbiológico clínico rotineiro." European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases 38 (2019): 1059-1070.
