Sequenciação de Nova Geração para Descoberta de Biomarcadores de Cancro

O que são biomarcadores?

Os biomarcadores são características moleculares, químicas ou celulares chave que podem ser medidas objetivamente e utilizadas para descrever processos biológicos, estados patológicos e respostas ao tratamento. Os biomarcadores podem estar relacionados a doenças ou a tratamentos. Os biomarcadores relacionados a doenças são diagnósticos (usados para determinar o estado da doença), prognósticos (fornecem informações sobre potenciais resultados clínicos, independentemente do tratamento) ou preditivos (fornecem informações sobre potenciais resultados clínicos em resposta a um tratamento específico).
Para que um biomarcador seja aceitável para aplicação clínica, deve ter as seguintes características:
1. ser facilmente e consistentemente detectável em fluidos biológicos, tecidos ou outros espécimes biológicos
2. ser rapidamente detectável e estável.
3. Alta sensibilidade e especificidade.
4. Forte correlação com o fenótipo ou resultado de interesse.
5. Pode ser detetado por testes simples, não invasivos e rentáveis.
6. Sem especificidade de género

Em vez disso, os biomarcadores do câncer devem ser específicos para o subtipo de câncer, fornecer informações sobre o potencial metastático do câncer e também devem ser detectáveis em amostras arquivadas, como FFPE (formol-fixado em parafina). Como o câncer é causado por aberrações genéticas e é uma doença heterogénea, biomarcadores moleculares, como variantes genéticas, perfis de expressão gênica e, em alguns casos, o estado de metilação genómica, podem fornecer informações mais acionáveis do que os marcadores tradicionais. Tecnologias de sequenciação capazes de realizar milhões de reações em paralelo têm um grande potencial para a deteção de biomarcadores e as suas aplicações.

NGS na descoberta de biomarcadores do câncer

As tecnologias de sequenciação, particularmente a NGS, são imparciais, completas e detalhadas na captura da heterogeneidade do câncer e da paisagem genética em rápida mudança no câncer, podendo melhorar significativamente as chances de identificar aberrações genéticas acionáveis. Além de detectar alterações nas sequências de DNA, a NGS também pode ser utilizada para análise do transcriptoma e deteção de metilação. O Cancer Genome Atlas (TCGA) é uma iniciativa de genoma tumoral, lançada em 2006 pelo National Cancer Institute e pelo National Human Genome Research Institute, para utilizar tecnologias de análise genómica de alto rendimento para ajudar a melhorar a compreensão dos tumores e a melhorar a prevenção, diagnóstico e tratamento dos tumores. Atualmente, o TCGA já contém informações sobre resultados de sequenciação, análise do transcriptoma, variantes de número de cópias, metilação de DNA e variantes de nucleotídeo único, abrangendo 33 tipos de tumores.

5 tipos de biomarcadores que podem ser identificados por NGS

• Variantes genéticas

As mutações na forma de variantes de nucleotídeo único, inserções, deleções e outras variantes estruturais estão associadas ao desenvolvimento do câncer, à progressão e ao potencial metastático, bem como à eficácia do tratamento. Por exemplo, mutações em BRCA1/2, KRAS, PTEN e outros foram identificadas como marcadores prognósticos e preditivos. ensaios baseados em NGS pode, portanto, ser utilizado para detectar mutações cancerígenas conhecidas e novas. Outra vantagem de usar NGS para testes de biomarcadores é que material genético de amostras arquivadas, como blocos FFPE, também pode ser utilizado.

Embora as aberrações genéticas em genes individuais possam informar o desenvolvimento de medicamentos e o diagnóstico, as células cancerígenas frequentemente apresentam vias de mutação em múltiplos genes, tornando um panorama de mutação mais detalhado de grande valor. Alguns painéis de NGS, projetados com base em conhecimento prévio, são agora capazes de detectar dezenas de genes associados ao câncer simultaneamente, como a maioria dos pacientes com mutações BRCA1/2. Além disso, muitos dos medicamentos anti-câncer aprovados pela FDA na última década têm como alvo aberrações genéticas específicas. Por exemplo, o gefitinibe foi aprovado para adenocarcinoma pulmonar com mutação EGFR e o virofenibe foi aprovado para pacientes com melanoma que apresentam uma mutação V600E no BRAF.

Principais genes como biomarcadores de cancro. (Lever J et al., 2019)

• Perfilagem da expressão génica

Existem muitas isoformas de um gene e um grande número de estudos demonstrou que isoformas específicas de genes são expressas no câncer de uma forma alterada. Análise do transcriptoma utilizando NGS tem vantagens muito distintas, uma vez que os dados de expressão são capturados a nível de isoforma, o que pode fornecer informações únicas e importantes sobre a progressão e metástase do câncer. O câncer da mama, o câncer colorretal e o glioblastoma são exemplos de tipos de câncer onde o perfil de expressão génica é amplamente utilizado. Além disso, a análise de biomarcadores por sangue total RNA-Seq permite a análise das diferenças de expressão em amostras de sangue, como a mais avançada biópsia líquida, que é um teste de sangue em vez de um teste de tecido tumoral, e pode fornecer referências e insights para monitorizar a recidiva do câncer e avaliar a eficácia.

• Modificações epigenéticas

As modificações epigenéticas são alterações no DNA que são independentes da variação da sequência do DNA. As modificações epigenéticas, como Metilação do DNAa acetilação e metilação de histonas têm efeitos profundos na expressão génica e são biomarcadores clássicos que podem ser utilizados para a deteção de cancro e desenvolvimento de intervenções terapêuticas. Exemplos de modificações epigenéticas utilizadas como biomarcadores incluem a hipermetilação do GSTP1 em pacientes com cancro da próstata e DAPK e hipermetilação do gene RASSF1A em cancro da bexiga. Tecnologias de alto rendimento, como sequenciação do epigenoma são bem adequados para identificar modificações epigenéticas como biomarcadores no câncer.

• MicroRNA

Os microARNs são pequenas moléculas de RNA de cadeia simples (19-22 nucleotídeos de comprimento) que desempenham um papel fundamental na regulação da expressão génica, direcionando o mRNA para degradação ou inibindo a tradução. A regulação da expressão génica mediada por microARNs é importante no desenvolvimento, diferenciação e crescimento celular, e, portanto, microARNs pode desempenhar um papel fundamental na carcinogénese. miR15 e miR16 demonstraram ter um papel importante na leucemia linfocítica crónica (LLC). miR206 está downregulado em 93% dos casos de cancro da mama. O papel dos microRNA no cancro é uma área de investigação muito ativa e é provável que muitas moléculas-chave ainda permaneçam por descobrir.

MicroARNs no câncer (Hayes J et al., 2014)

• DNA tumoral circulante

O DNA tumoral circulante (ctDNA) refere-se à libertação de DNA somático das células tumorais para o sistema circulatório, seja através da descamação ou quando ocorre apoptose. O ctDNA é o fragmento de DNA do genoma tumoral que flui constantemente no sistema circulatório humano, transportando certas características (incluindo mutações, deleções, inserções, rearranjos, anomalias no número de cópias, metilação, etc.). O DNA tumoral circulante é cfDNA (DNA livre de células) derivado de células tumorais e pertence a um tipo de cfDNA. Atualmente, a análise multigénica ou até mesmo do genoma completo de amostras de ctDNA é frequentemente realizada utilizando NGS, que permite a deteção de várias mutações, incluindo fusões ALK com ROS1, através da utilização de técnicas de captura de sondas de RNA.

ctDNA como Biomarcador de Cancro (Pessoa L S et al., 2020)

Desafios da NGS na descoberta de biomarcadores do câncer

• Variantes de Significado Indeterminado

As variantes de Significado Indeterminado (VUS) são variantes de DNA cujo impacto funcional não foi totalmente caracterizado. A presença de VUS em regiões genómicas importantes para a doença em consideração pode criar uma grande incerteza na determinação de ações futuras e, portanto, às vezes pode ser contraproducente. Os testes para identificação de biomarcadores devem fornecer informações precisas e específicas que possam ser utilizadas de forma fiável para orientar a gestão da doença, e as VUS identificadas por NGS apresentam um desafio significativo à sua utilidade como testes padrão.

• Análise e interpretação de dados complexos

No contexto da descoberta de biomarcadores do câncer, o NGS gera vastas quantidades de dados complexos, incluindo variações genéticas, padrões de expressão gênica e modificações epigenéticas. Esta complexidade pode tornar a análise e interpretação dos dados desafiadoras, particularmente para investigadores sem habilidades computacionais e estatísticas especializadas. Além disso, o desenvolvimento de ferramentas de bioinformática robustas e fiáveis para a análise e interpretação de dados de NGS é essencial. Estas ferramentas devem ser capazes de identificar e anotar variantes genéticas com precisão, prever o seu impacto funcional e priorizar aquelas que são mais propensas a ser clinicamente relevantes.

Referências:

1. Desai A N, Jere A. Sequenciação de Nova Geração para Descoberta de Biomarcadores de Câncer[J]. Sequenciação de Nova Geração na Pesquisa do Câncer, Volume 2: Dos Pares de Bases aos Leitos, 2015: 103-125.
2. Pessoa L S, Heringer M, Ferrer V P. ctDNA como biomarcador de cancro: Uma visão geral abrangente[J]. Revisões críticas em oncologia/hematologia, 2020, 155: 103109.
3. Lever J, Jones M R, Danos A M, et al. Mineração de texto de biomarcadores de câncer clinicamente relevantes para curadoria na base de dados CIViC[J]. Medicina Genómica, 2019, 11: 1-16.
4. Hayes J, Peruzzi P P, Lawler S. MicroRNAs no câncer: biomarcadores, funções e terapia[J]. Trends in Molecular Medicine, 2014, 20(8): 460-469.