Os Princípios e o Fluxo de Trabalho do Microarray de SNP

O que é um microarray de SNP?

microarray de SNP, uma tecnologia de microarray especializada, é direcionada para a deteção de Polimorfismos de Nucleótido Único (SNPs), caracterizando variações em um único par de bases no genoma. Surgiu nos últimos anos, microarray de SNP a tecnologia representa uma plataforma de testes genéticos de alto rendimento e grande escala. O princípio de funcionamento envolve principalmente a hibridização de ADN de cadeia simples fragmentado com uma matriz composta por centenas de milhares de sequências de sondas nucleotídicas únicas.

Polimorfismo de nucleótido único (SNP) refere-se à diferença de um único nucleótido na mesma posição na sequência de ADN genómico. Em geral, uma variação de nucleótido único com uma frequência superior a 1% é chamada de SNP. Os SNPs envolvem apenas uma variação de uma única base, que pode ser causada por uma transição ou transversão de base única. Existe aproximadamente um SNP por 1000 bases no genoma humano, e o número total de SNPs no genoma humano é cerca de 3 x 10^6.

Os SNPs tornaram-se a terceira geração de marcadores genéticos. As características dos SNPs tornam-nos mais adequados para estudos sobre pleiotropia genética em traços e doenças complexas, bem como para o reconhecimento de genes em populações do que outros marcadores polimórficos. Os SNPs têm uma importância significativa na investigação biomédica. Os SNPs têm sido utilizados em estudos de associação em todo o genoma como marcadores de alta resolução no mapeamento de genes relacionados a doenças ou traços normais. Os SNPs sem um impacto observável no fenótipo (chamadas mutações silenciosas) podem também ser úteis devido à sua quantidade e herança estável ao longo das gerações.

Figura 1. A molécula de DNA superior difere da molécula de DNA inferior em um único local de par de bases (um polimorfismo C/A).

O ADN microarranjo refere-se a um chip genético com um grande número de sequências de DNA de sondas dispostas de forma específica imobilizadas em um substrato sólido. O princípio é a teoria da hibridação de ácidos nucleicos, e o DNA da amostra detectada é hibridizado com o microarray de DNA e estendido. Subsequentemente, os fragmentos da reação de ligação não complementar no chip são lavados, e o chip genético é submetido a uma varredura confocal a laser. As intensidades do sinal de fluorescência são então medidas e interpretadas como a abundância de diferentes genes através de um determinado processamento de dados.

Princípios do Microarray de SNP

O princípio fundamental de microarranjos SNP envolve uma única estratégia de hibridização onde amostras de DNA, para análise, passam por hibridização com sondas integradas no chip. O número de cópias em cada locus pode ser posteriormente determinado comparando as intensidades de sinal entre várias amostras.

microarrays de SNP aproveitar as diferenças nos loci SNP entre indivíduos. Convencionalmente, a deteção de locais SNP baseia-se no alinhamento de sequências de DNA. Dentro microarrays de SNP, são utilizadas sondas com diferentes variações de SNP. Estas sondas correspondem especificamente aos locais de SNP. Através da hibridização do DNA das amostras, o genótipo de cada local de SNP pode ser determinado. Além disso, a frequência de diferentes genótipos pode ser avaliada medindo a intensidade do sinal.

Comparado com os métodos tradicionais de diagnóstico de célula única, microarray de SNP serve como uma abordagem de alto rendimento, capaz de realizar milhares de reações na superfície do chip de oligonucleotídeos simultaneamente.

Figura 2. O princípio do microarray.

Fluxo de Trabalho do Microarray de SNP

O fluxo de trabalho geral de microarray de SNP está mostrado na figura 3. De forma resumida, existem vários processos: fabrico do chip SNP, preparação do DNA genómico da amostra, hibridização e escaneamento por fluorescência.

Figura 3. O fluxo de trabalho do microarray de SNP.

Design de Sonda

O processo envolve a recolha de informações de sequência genómica a partir dos locais-alvo de Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNP). As informações conhecidas sobre SNP são então alinhadas com a sequência do genoma de referência, o que determina a posição e a base variável dos locais de SNP. Utilizando informações de sequência em torno dos locais de SNP, é projetado um conjunto de sondas específicas. Isso garante que as sondas se emparelhem seletivamente com as bases variáveis nos locais-alvo de SNP.

Ao projetar as sondas, são realizados experimentos in vitro para avaliar o desempenho de hibridização das sondas, incluindo a eficiência de hibridização sob condições como temperatura e concentração de sal. O comprimento das sondas é controlado, geralmente variando entre 20 a 70 bases, de forma a garantir uma hibridização estável e uma deteção de sinal fiável. Na fase de design da sonda, a sequência complementar reversa da localização do SNP alvo também é considerada para facilitar a deteção bidirecional de mutações.

Fabricação de chip SNP

Os oligonucleotídeos ou chips de cDNA pré-projetados são dispostos de forma ordenada e em alta densidade no suporte de vidro para criar microarrays ou chips principais. Os métodos de fabrico do chip incluem síntese in situ guiada por luz, método de pulverização química, método de revestimento por contacto, síntese controlada de DNA in situ, método de impressão micromecânica sem contacto TOPSPOT® e reprodução por litografia suave, entre outros. Um total de 4x10^5 diferentes moléculas de DNA pode agora ser colocado num chip de 1 cm². A tecnologia Affymetrix GeneChip® permite alta densidade, in situ síntese de oligonucleotídeos e tem sido um pioneiro neste campo.

Preparação de DNA genómico em amostra

Na preparação de amostras de DNA genómico, um passo inicial é adquirir material de amostra adequado. A seguir, é imperativo extrair DNA genómico e depois amplificá-lo através da Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR). Por fim, utilizando diferentes corantes fluorescentes, as amostras são rotuladas para análise posterior.

A concentração e pureza das amostras de DNA são de extrema importância. Estas podem ser avaliadas utilizando técnicas espectrofotométricas, como colorimetria, espectroscopia de absorção ultravioleta ou ensaios que utilizam corantes fluorescentes. Estes procedimentos garantem que o DNA extraído tenha qualidade suficiente e não apresente contaminação evidente. Além disso, em conformidade com os requisitos experimentais, é escolhida uma metodologia de rotulagem apropriada. As técnicas de rotulagem comumente implementadas incluem rotulagem por fluorescência, rotulagem por biotina, bem como rotulagem por isótopos radioativos.

Hibridação e digitalização

Passando para a hibridação e escaneamento, o DNA genómico marcado com fluorescência hibridiza com o microarray de SNP sob condições de reação adequadas. Após a lavagem, a fluorescência é escaneada com um scanner de fluorescência especificamente projetado. Em seguida, os dados são processados através de análise de imagem computacional e posteriormente submetidos a uma análise bioinformática dos genes-alvo.

Em primeiro lugar, a extensão da otimização de várias condições de hibridação — como temperatura, concentração de sal e tempo de hibridação — é de extrema importância para garantir uma ligação suficiente do DNA com as sondas. Subsequentemente, durante a eluição, as condições de eluição devem ser cuidadosamente controladas para garantir que apenas o DNA que se liga à sonda seja retido no chip, evitando assim a possibilidade de DNA não ligado comprometer a precisão dos resultados.

Vantagens e Limitações do Microarray de SNP

As vantagens deste processo incluem a capacidade de detectar simultaneamente múltiplos locais SNP de forma rápida, resultando numa grande quantidade de dados SNP em um único experimento. Este procedimento é aplicável numa ampla gama de áreas, como investigação relacionada com o genoma, análise de genótipos individuais e estudos de suscetibilidade a doenças, e proporciona um nível mais elevado de precisão na deteção de variação no número de cópias do que o sequenciamento de nova geração, incluindo o sequenciamento de genoma completo (WGS). Também possui uma resolução superior a hibridização genómica comparativa em array (aCGH)capaz de detectar a perda de cópias neutras de heterozigotos, certas formas de disomia uniparental e alterações na ploidia.

No entanto, existem limitações, uma vez que este método é limitado por informações de SNP conhecidas e não consegue detetar mutações de SNP desconhecidas. Os métodos de rotulagem podem introduzir viés e afetar a precisão dos resultados. Além disso, lidar com dados extensos requer métodos de análise complexos e computação, e o custo para a preparação de chips, reagentes e equipamentos é relativamente elevado.

Aplicação de Microarray de SNP

Os microarrays de SNP tornaram-se um instrumento frequentemente utilizado em várias áreas, incluindo investigação genómica, medicina personalizada, diagnóstico de doenças e desenvolvimento de medicamentos.

A genotipagem de SNP, o processo de identificação das variantes genéticas de um indivíduo, permite-nos determinar as características genéticas de uma pessoa, incluindo diferentes alelos em vários loci ao longo do genoma. Além disso, ao analisar a distribuição de frequência dos loci de SNP em diferentes populações ou grupos étnicos, podemos obter informações sobre a estrutura genética e a história evolutiva desses grupos.

Análise comparativa de microarray de SNP dados entre pacientes com uma doença e participantes saudáveis de controlo podem identificar loci SNP associados a distúrbios genéticos, proporcionando assim uma visão sobre os fundamentos genéticos da doença. A técnica SNP apresenta-nos oportunidades para descobrir correlações com doenças complexas (como câncer, doenças cardiovasculares, distúrbios mentais, etc.) e explorar os seus fatores de risco genéticos.

Uma análise do perfil genético do paciente oferece um meio de prever a sua suscetibilidade a influências ambientais e predisposições a doenças, proporcionando assim uma base para a prevenção personalizada de doenças e gestão da saúde. É utilizada para detectar variações estruturais genómicas, como SNPs e CNVs, revelando a estrutura e função do genoma.

Figura 4. Visão do genoma completo a partir de um microarray de SNP realizado na amostra de medula óssea diagnóstica submetida para investigação de LLA. (Berry et al., 2019)

Além disso, Microarranjos SNP são amplamente utilizados em estudos de associação em todo o genoma (GWAS)Ao analisar SNPs em grandes amostras, os investigadores podem identificar loci de SNP relacionados a fenótipos ou doenças específicas e explorar a sua base genética.

Nos últimos anos, métodos fundamentados em Microarranjos SNP têm sido incorporadas nos diagnósticos pré-natais. Isto deve-se principalmente à capacidade da análise de SNP para diagnosticar regiões de homozigose (ROH), translocações desequilibradas e outros aspectos no diagnóstico de doenças genómicas. Estas técnicas apresentam vantagens consideráveis em relação à análise tradicional do cariótipo cromossómico, destacando-se como tecnologias de diagnóstico genético de primeira linha indispensáveis nos contextos clínicos contemporâneos.

Diferença entre microarray CGH e SNP

As tecnologias de microarrays CGH e microarrays SNP desempenham papéis vitais na análise do genoma. No entanto, existem diferenças nos seus princípios, aplicações, méritos e deméritos.

Princípios:

Microarray CGHDesdobrado para deteção Variações no Número de Cópias (VNC) Dentro do DNA genómico, o princípio da CGH envolve a marcação do DNA da amostra e do DNA de referência simultaneamente, seguida da sua hibridação no chip. As variações no número de cópias no DNA da amostra podem ser determinadas ao contrastar a intensidade do sinal entre o DNA da amostra e o DNA de referência.

Microarray de SNPO microarray SNP é projetado principalmente para identificar Polimorfismos de Nucleotídeo Único, ou seja, variações em pares de bases individuais no genoma. O seu princípio subjacente consiste em hibridizar o DNA da amostra com sondas SNP no chip e determinar genótipos em cada locus SNP através da intensidade do sinal da hibridização entre a sonda e o DNA da amostra.

Aplicações:

Microarray CGHA sua principal aplicação é a deteção de CNVs, como duplicação, deleção ou amplificação de genes, e a identificação de variações estruturais cromossómicas. É amplamente utilizada na investigação em genómica do cancro e no diagnóstico de doenças genéticas.

Microarray de SNPUtilizado predominantemente para detectar Polimorfismos de Nucleotídeo Único, incluindo identificação de genótipos, análise genómica individual, investigação de suscetibilidade, análise da estrutura genética populacional, etc. Tem uma ampla utilidade em Estudos de Associação Genómica (GWAS).

Vantagens e Desvantagens:

Microarray CGHVantagens: Permite a deteção simultânea de grandes CNV segmentos no genoma com uma ampla cobertura, que são adequados para descobrir CNVs novos. Desvantagens: Não oferece dados detalhados de SNP, sendo assim incapaz de detectar variações de pares de bases únicas, demonstrando uma capacidade relativamente fraca para a deteção de variações de pequenos fragmentos.

Microarray de SNPVantagens: Fornece dados diretos de SNP, tornando-o adequado para genotipagem individual e estudos relacionados com doenças, com alta resolução e especificidade. Desvantagens: Só consegue detectar locais de SNP conhecidos, não fornecendo informações sobre variações desconhecidas e deteção direta de CNV.

Na CD Genomics, estamos dedicados a fornecer serviços de genotipagem de SNPs fiáveis, incluindo genotipagem por sequenciação, microarray de SNP, Genotipagem de SNPs MassARRAY, Sistema SNaPshot Multiplex para genotipagem de SNPse Genotipagem de SNP TaqMan.

Referências:

1. Iwamoto K, Bundo M, Ueda J, et al. Detecção de alterações estruturais cromossómicas em células únicas por arrays de SNP: um inquérito sistemático do viés de amplificação e fluxo de trabalho otimizado. Plos One, 2007, 2(12): e1306.
2. Ho C C, Mun K S, Naidu R. Tecnologia de array SNP: uma esperança na investigação do câncer de mama. Revista Malaia de Patologia, 2013, 35(1):33-43.
3. Ahmad A, Iqbal M A. Significado da análise do genoma inteiro de alterações no número de cópias e UPD em síndromes mielodisplásicas utilizando arrays CGH-SNP combinados. Química Medicinal Atual, 2012, 19(22).
4. Sund K L, Zimmerman S L, Thomas C, et al. Regiões de homozigose identificadas por análise de microarranjos SNP ajudam no diagnóstico de doenças autossómicas recessivas e detectam incidentalmente relações de parentesco entre os pais. Genetics in Medicine Jornal Oficial do Colégio Americano de Genética Médica, 2013, 15(1):70-78.
5. Liu S, Zhou Z, Lu J, et al. Geração de SNPs associados a genes em escala genómica em peixe-gato para a construção de uma matriz de SNPs de alta densidade. Bmc Genomics, 2011, 12(1):53.
6. Fang Z, Che D, Gu X. O polimorfismo da LncRNA HULC está associado à suscetibilidade ao aborto espontâneo recorrente na população do Sul da China. Fronteiras em Genética, 2019, 10: 471328.
7. Berry N K, Scott R J, Rowlings P, et al. Uso clínico de microarrays de SNP para a deteção de alterações genómicas em malignidades hematológicas. Revisões críticas em oncologia e hematologia, 2019, 142: 58-67.