As Vantagens e o Fluxo de Trabalho do 2b-RAD

O que é RAD-seq?

Atualmente, a aplicação da tecnologia de sequenciação de representação reduzida em genotipagem de SNP em grande escala e de alto rendimento é uma área de pesquisa em destaque. Enzimas de restrição são utilizadas para fragmentar o DNA genómico, depois alguns fragmentos característicos são selecionados e submetidos à tecnologia de sequenciação de nova geração para identificação de marcadores genéticos dentro do genoma de forma de alto rendimento. A tecnologia de sequenciação de representação reduzida mais amplamente utilizada, a sequenciação de DNA associada a sítios de restrição (RAD-seq), foi desenvolvida por investigadores da Universidade de Oregon. Comparado com bibliotecas de extremidade pareada e bibliotecas de pares de mate, a tecnologia RAD-seq com método de pooling pode construir até 96 bibliotecas de sequenciação de uma só vez, o que é bastante conveniente para a operação experimental e rentável. Mais importante ainda, não depende da informação do genoma de referência.

A tecnologia RAD-seq é uma sequenciação de alto rendimento de fragmentos específicos de enzimas de restrição. Milhões de marcadores genéticos de polimorfismo podem ser obtidos com uma única sequenciação, e o RAD-seq tem sido amplamente utilizado em ecologia, genética, genómica e outros campos de investigação. De acordo com o tipo e a quantidade de endonuclease de restrição utilizada, o RAD-seq pode ser dividido em RAD-seq original, 2b-RAD, ddRAD, ezRAD, GBS (genotipagem por sequenciação) e outros métodos.

Vantagens do 2b-RAD em relação a outras sequências RAD

2b-RAD é um tipo de tecnologia RAD-seq, que é realizada com base em fragmentos uniformes gerados por endonuclease de restrição tipo IIB. O 2b-RAD supera efetivamente algumas das limitações do RAD-seq, como o processo complicado de construção de bibliotecas e os comprimentos variados dos fragmentos de DNA restritos. Revisámos as principais vantagens do 2b-RAD em relação a outras tecnologias de sequenciamento RAD, que estão listadas a seguir.

(1) Mais tipos e números de marcadoresO número de loci obtidos por diferentes tecnologias de RAD-seq varia bastante. No geral, o 2b-RAD consegue obter mais loci e é mais adequado para estudar a relação evolutiva, a estrutura populacional, o fluxo gênico e outros problemas relacionados. Além de SNP, o 2b-RAD também pode fornecer marcadores dominantes e informações sobre CNV.

(2) Etiquetas independentesAs etiquetas 2b-RAD são independentes, o que pode reduzir a redundância de dados e aumentar o conteúdo de informação. Outras tecnologias Rad-seq são propensas a detetar uma sequência de cada lado de um sítio de restrição, e a informação fornecida por fragmentos adjacentes está completamente ligada, equivalente à redundância de dados. A técnica 2b-RAD fornece mais informação porque o ponto de contacto está de ambos os lados, tornando impossível que duas etiquetas sejam completamente adjacentes.

(3) Todas as sequências da bibliotecaPara 2b-RAD, todos os fragmentos de enzimas cortados pela enzima de restrição são utilizados para sequenciação, garantindo que os locais de restrição não sejam perdidos. Isso proporciona uma cobertura de ultra-alta densidade do genoma, e a informação é mais completa. Em teoria, a distância média de distribuição dos marcadores 2b-RAD no genoma é de 2 kb. Ou seja, podem ser obtidos mais de 200.000 marcadores em um genoma de 1G de tamanho.

(4) Alta repetibilidadeO processo de 2b-RAD é simples e tem uma alta repetibilidade técnica. O resultado é altamente consistente após uma amostra ter sido sequenciada duas vezes. Utiliza a estratégia N+1, pelo que cada projeto realizará uma repetição técnica para um indivíduo por defeito. Ou seja, a mesma amostra repetirá a construção da sequenciação da biblioteca uma vez, prometendo que a taxa de recorrência da etiqueta da mesma amostra não deve ser inferior a 95% entre dois experimentos, e a taxa de recorrência da marca não deve ser inferior a 85%.

(5) Profundidade uniforme de sequenciaçãoA técnica 2b-RAD gera etiquetas de corte enzimático de comprimento igual de 33-36 bp, que são enriquecidas para a reação de sequenciação de alto débito a jusante, e a triagem e análise de tipagem SNP em todo o genoma são realizadas através de análise bioinformática. A profundidade uniforme de sequenciação garante a fiabilidade e precisão de cada etiqueta.

Tabela 1. As vantagens do 2b-RAD em relação a outras tecnologias de Rad-seq.

Fluxo de trabalho do 2b-RAD

O núcleo do 2b-RAD é a aplicação da endonuclease de restrição tipo IIb (Figura 1). Este tipo de endonuclease reconhece seis bases de DNA de cadeia dupla, e então corta o DNA a montante e a jusante do local de reconhecimento, resultando numa sequência de etiqueta de 27bp. A extremidade 3' da etiqueta é destacada com 3 bases, que também são completamente aleatórias na sua composição. O adaptador adequado para a plataforma de sequenciação de alto rendimento é ligado a ambos os lados da etiqueta, e após a amplificação por PCR, pode ser utilizado para sequenciação.

Figura 1. Preparação e sequenciação de etiquetas 2b-RAD.

(1) Preparação e digestão da amostraO DNA genómico é extraído e a sua concentração, contaminação por proteínas e RNA são detetadas. O DNA é digerido com a enzima de restrição II. Uma amostra adicional pode ser digerida simultaneamente para detetar a eficiência da digestão por eletroforese em gel de agarose a 1%. A banda principal de DNA desapareceu e tornou-se dispersa, indicando uma digestão bem-sucedida.

(2) Adaptador a conectarAdaptadores específicos são anexados aos fragmentos de restrição produzidos acima. Nesta fase, a representação reduzida de etiquetas (RTR) pode ser obtida para direcionar um subconjunto dos locais de restrição para genotipagem.

(3) AmplificaçãoA amplificação por PCR utiliza uma DNA polimerase de alta fidelidade e um conjunto de primers. Estes primers podem introduzir códigos de barras específicos da amostra e as sequências necessárias para o enriquecimento por esferas no sistema de sequenciação. Em média, são realizadas três reações de amplificação para cada amostra, que são depois fundidas. Os produtos de PCR fundidos foram purificados por eletroforese.

(4) Sequenciação. As bibliotecas qualificadas são sequenciadas em plataformas SOLiD ou Illumina. As bibliotecas padrão BsaXI para Illumina são serializadas e, em seguida, sequenciadas em pares pelo Hiseq X-ten, PE150 ou pela plataforma Hiseq 2500 v2.

(5) Controlo de qualidadeAs plataformas SOLiD e Illumina produzem leituras com 35 bp de comprimento. A posição da etiqueta terminal deve ser excluída em cada leitura para eliminar a influência de artefatos. Em seguida, regiões longas de homopolímeros, posições de baixa qualidade excessiva e leituras pouco claras são eliminadas. As leituras de alta qualidade restantes são utilizadas para a próxima análise.

(6) Alinhamento de sequênciasPara a análise baseada em referência, o pacote de software SHRiMP é utilizado para o alinhamento de leituras de alta qualidade contra a base de dados de referência. Para de novo análise, o pacote de software CD-HIT é utilizado para organismos que não possuem uma sequência genómica completa.

(7) Análise avançada

I) Construção de mapas de ligação de alta precisão. Com base nos resultados da genotipagem, o software Joinmap pode ser utilizado para construir o mapa de ligação genética, e finalmente integrar o mapa genético com o MergeMap e outros softwares.

II) Localização de locus de traço quantitativo (QTL). Com base nos dados fenotípicos e no mapa de ligação de alta densidade, pode-se alcançar a localização precisa do QTL do traço quantitativo ou do traço de qualidade. Os resultados da análise de correlação podem ser utilizados para ajudar a avaliar a fiabilidade dos resultados da análise de QTL.

III) Genética populacional. De acordo com o número de marcadores entre diferentes grupos e entre diferentes indivíduos dentro do grupo, a presença ou ausência do mesmo marcador, a frequência gênica e a frequência de genótipos dos marcadores SNP dentro do marcador, a diferenciação populacional e a evolução podem ser avaliadas.

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Referências:

1. Andrews, K. R., Good, J. M., Miller, M. R., Luikart, G., & Hohenlohe, P. A. (2016). Aproveitar o poder do RADseq para genómica ecológica e evolutiva. Nature Reviews Genetics, 17(2), 81-92.
2. Wang, S., Meyer, E., Mckay, J. K., & Matz, M. V. (2012). 2b-RAD: um método simples e flexível para genotipagem em todo o genoma. Métodos da Natureza, 9(8), 808.
3. Baird, N. A., Etter, P. D., Atwood, T. S., Currey, M. C., Shiver, A. L., & Lewis, Z. A., et al.. (2008). Descoberta rápida de SNPs e mapeamento genético utilizando marcadores RAD sequenciados. PLoS One, 3(10), e3376.
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