Diretrizes para Submissão de Amostras
Perguntas e Respostas sobre Sequenciamento RIP
Perguntas Gerais
- Que informações devo saber antes de realizar o RIP-Seq?
- Antes de realizar um RIP-SEQ, geralmente é necessário especificar
• O tipo de amostra a ser realizada
• Quais são as RBP de interesse
• Se existem anticorpos a nível de IP para estas RBPs
• O tipo de sequências de RNA ligadas pelas RBP de interesse (por exemplo, mRNA, miRNA, lncRNA, circRNA, etc.)
- Antes de realizar um RIP-SEQ, geralmente é necessário especificar
- Quais são os requisitos para selecionar IP endógeno para RIP-seq?
- Normalmente, para IP endógeno, existem algumas condições necessárias a serem cumpridas - (i) deve haver um anticorpo de grau IP; (ii) a quantidade inicial de proteína deve ser grande o suficiente.
- Como escolher o anticorpo para RIP?
- Devido à baixa abundância de ligação de proteínas e RNA, a eficiência da IP geralmente não é muito alta, a quantidade de RNA é pequena e há um maior risco na construção da biblioteca, por isso pode optar por várias IPs para aumentar a quantidade de produto.
- Por que é que a WB realiza uma avaliação pré-experimento antes do experimento RIP?
- Os principais propósitos do Western Blot são (i) detectar a especificidade do anticorpo e se este pode ligar-se à proteína alvo; (ii) identificar as bandas da proteína alvo por espectrometria de massa; e (iii) detectar se a proteína alvo está expressa na amostra e o seu nível de abundância.
- O meu anticorpo tem uma banda de proteína alvo para WB, mas por que não há banda para RIP?
- Existem muitos ensaios imunoassay com diferentes propósitos, como WB, ELISA, IP, IF, ChIP, IHC(P), FACS, entre os quais apenas o WB é um experimento que requer a desnaturação de proteínas. Neste caso, qualquer anticorpo para esta proteína pode reconhecer o antigénio que se torna linear no WB; no entanto, os anticorpos que podem ser utilizados no WB podem não ser adequados para testes não desnaturantes de IP, IF e IHC, porque a estrutura tridimensional das proteínas naturais oculta muitos locais de ligação dos anticorpos, e os anticorpos de nível WB não conseguem ligá-los.
Para realizar experiências de RIP, é necessário comprar anticorpos a nível de IP.
- Existem muitos ensaios imunoassay com diferentes propósitos, como WB, ELISA, IP, IF, ChIP, IHC(P), FACS, entre os quais apenas o WB é um experimento que requer a desnaturação de proteínas. Neste caso, qualquer anticorpo para esta proteína pode reconhecer o antigénio que se torna linear no WB; no entanto, os anticorpos que podem ser utilizados no WB podem não ser adequados para testes não desnaturantes de IP, IF e IHC, porque a estrutura tridimensional das proteínas naturais oculta muitos locais de ligação dos anticorpos, e os anticorpos de nível WB não conseguem ligá-los.
- Existem experiências de controlo de qualidade que precisam de ser realizadas após a imunoprecipitação em experiências de RIP?
- Após a imunoprecipitação, por um lado, as proteínas enriquecidas são submetidas a um controlo de qualidade por WB para testar a especificidade da IP e o efeito de enriquecimento da proteína alvo. Por outro lado, o RNA deve ser extraído para análise quantitativa e a biblioteca de sequenciamento construída deve ser verificada quanto à qualidade.
- O que devo ter em atenção em experiências de RIP?
- 1. Prevenir a ligação não específica de RNA a proteínas
2. Evitar a interrupção da ligação RNA-proteína
3. Evitar a contaminação por RNase exógena
4. Inibir a atividade da RNase endógena
5. Selecione anticorpos adequados para RIP
6. Evitar a degradação de proteínas ligadoras de RNA.
- 1. Prevenir a ligação não específica de RNA a proteínas
- Como avaliar os resultados de QC do WB após experimentos de RIP?
- 1. Se a proteína alvo estiver expressa na amostra e o anticorpo for eficaz, a proteína alvo pode ser detectada na amostra e a entrada produz uma banda na posição correspondente.
2. Se o anticorpo utilizado puder enriquecer efetivamente a proteína alvo, então a IP também produzirá uma banda na posição correspondente; além disso, também haverá bandas de anticorpos, que se devem ao fato de que o anticorpo está fortemente ligado à proteína e não pode ser separado antes da carga da amostra, e a cadeia pesada (ou cadeia leve) do anticorpo secundário marcado com enzima-conjugado adicionado durante o QC de WB produzirá uma banda a 55kD (ou 25kD).
3. A IgG pode ajudar-nos a determinar se o sistema de imunoprecipitação tem ligação não específica à proteína ou não, e o resultado da RIP com alta especificidade deve não ter banda de destino e apenas a banda da cadeia pesada (ou leve) da IgG.
- 1. Se a proteína alvo estiver expressa na amostra e o anticorpo for eficaz, a proteína alvo pode ser detectada na amostra e a entrada produz uma banda na posição correspondente.
- Como descobrir miRNA através de RIP-seq e estudar para prever a sua função?
- Os miARNs podem regular processos celulares relacionados com a função neuronal, incluindo a formação de neurossinapses. Tomamos o exemplo de estudar miARNs em neurónios. Ao construir um vetor marcado com GFP e injetá-lo nos cérebros de ratos, obtivemos miARN e mRNA alvo utilizando RIP; e verificámos a eficiência do RIP através de qRT-PCR. Em seguida, os fragmentos de RNA obtidos por RIP foram sequenciados em alta capacidade e comparados com o genoma de referência de ratos e a base de dados miRbase, respetivamente, para anotação e análise de enriquecimento de função GO, entre outros, para descobrir as funções dos miARNs.
- É o RNA enriquecido em IP o RNA que se liga à proteína-alvo?
- Não exatamente, o RIP enriquece o RNA de ligação à proteína-alvo, portanto, a cobertura das leituras de sequenciamento é maior nas regiões de ligação à proteína do genoma de referência, formando picos óbvios em comparação com outras regiões. No entanto, devido às diferenças na expressão de RNA e às preferências introduzidas pelos processos de amplificação e sequenciamento, a cobertura das leituras em regiões não enriquecidas também pode apresentar picos altos e baixos, o que interfere, sem dúvida, na triagem de picos de ligação (chamada de picos).
Preparação de Amostras
- Como armazenar as amostras para RIP-seq?
- Após os amostras serem isoladas e rapidamente limpas e rotuladas, devem ser imediatamente congeladas a frio em azoto líquido durante pelo menos 30 minutos e, em seguida, armazenadas em um frigorífico a -80°C ou em gelo seco para garantir que as amostras estejam sempre a -80°C antes da operação experimental, a fim de evitar a degradação das proteínas.
- Pode o RNA extraído ser utilizado para experiências de RIP?
- Claro que não, porque o RIP-Seq é realizado puxando a proteína de ligação ao RNA (RBP) com um anticorpo específico, que se liga à sequência de RNA, e depois a sequência de RNA ligada é medida. Já não há RBP no RNA total extraído.
- Qual é a quantidade de tecido animal amostrada para RIP-seq? E como amostrar?
- Tecidos animais
1. Remover tecido fresco, que deve excluir tipos de tecido não necessários para o estudo, como tecido conjuntivo e adiposo.
2. Enxagúe rapidamente a superfície do tecido com solução salina a 0,9% pré-arrefecida para remover qualquer sangue residual.
3. Se o tecido for grande, tente cortar o tecido em pequenos pedaços ≤ 0,5 cm de comprimento, largura e altura (ou seja, o tamanho de uma soja).
4. Misture bem as amostras de tecido processadas e armazene em um tubo de liofilização com tampa de rosca de 10 ml ou maior, devidamente rotulado.
Coloque rapidamente em azoto líquido durante 30 minutos e, em seguida, transfira para -80°C ou azoto líquido para armazenamento.
6. Transporte: Coloque os tubos liofilizados em tubos de centrífuga de 50 ml ou em sacos plásticos bem selados e transporte sobre gelo seco.
O tamanho da amostra para tecidos animais
1. Animais individuais menores, como ratos, pintainhos, peixes-zebra, etc. fígado, coração, cérebro e outros tecidos: >1g.
2. Animais individuais maiores, como porcos, gado, ovelhas, etc. músculo, embrião tardio e outros tecidos: >2g de tecido adiposo >10g.
3. Indivíduos inteiros como insetos: >3g.
- Tecidos animais
- Se estiver a estudar amostras de tumores, quais são os requisitos de amostra para RIP-Seq?
- 1. Para os tecidos tumorais, os tecidos tumorais e normais devem ser determinados com a maior precisão possível, e se possível, por favor, avalie o local de amostragem a ser estudado com base nos resultados do relatório da secção congelada, e os tecidos tumorais devem ser excisados a partir dos tecidos normais circundantes (os tecidos normais também devem ser excisados a partir dos tecidos tumorais circundantes).
2. Imediatamente após a isolamento, divida o tecido, com aproximadamente 2-3 mm de espessura, e coloque o tecido num tubo de liofilização com tampa de rosca de 2,0 ml ou maior.
3. Congelar rapidamente em nitrogénio líquido durante 30 minutos, depois transferir para -80°C ou nitrogénio líquido para armazenamento.
4. Transporte: Coloque os tubos liofilizados em tubos de centrífuga de 50 ml ou em pequenos sacos plásticos com boa vedação e transporte em gelo seco.
5. Tecido tumoral: >1 g.
- 1. Para os tecidos tumorais, os tecidos tumorais e normais devem ser determinados com a maior precisão possível, e se possível, por favor, avalie o local de amostragem a ser estudado com base nos resultados do relatório da secção congelada, e os tecidos tumorais devem ser excisados a partir dos tecidos normais circundantes (os tecidos normais também devem ser excisados a partir dos tecidos tumorais circundantes).
- Pode o tecido vegetal ser utilizado para RIP-SEQ? Quantas amostras de plantas preciso fornecer?
- Os rendimentos de enriquecimento de IP são baixos, e a construção da biblioteca pode falhar se a quantidade inicial necessária não for alcançada. Especialmente para tecidos vegetais, a quantidade de amostras enviadas deve ser garantida, uma vez que folhas, frutos, tubérculos ou rizomas de plantas contêm altas concentrações de substâncias polissacarídicas polifenólicas, bem como outros componentes complexos desconhecidos, que são difíceis de extrair.
1. Do corpo da planta, são retirados tecidos frescos. Para o material obtido em campo, a poeira ou o solo na superfície do material devem ser enxaguados e secos com um pano após a extração.
2. Se o tecido for grande, deve ser cortado em pequenos pedaços tanto quanto possível e, em seguida, colocado num tubo de liofilização de 10 ml ou maior, ou envolto firmemente em papel de alumínio e colocado num saco autoclavável, devidamente rotulado.
3. Coloque rapidamente em azoto líquido durante 30 minutos e, em seguida, transfira para -80°C ou azoto líquido para armazenamento.
4. Volume da amostra. Raça: >5g. Sistema radicular: >5g. Caules: >5g. Folhas: >5g. Fruto: >10g. Sementes: >5g. Inflorescência, estames, pólen: >2g.
- Os rendimentos de enriquecimento de IP são baixos, e a construção da biblioteca pode falhar se a quantidade inicial necessária não for alcançada. Especialmente para tecidos vegetais, a quantidade de amostras enviadas deve ser garantida, uma vez que folhas, frutos, tubérculos ou rizomas de plantas contêm altas concentrações de substâncias polissacarídicas polifenólicas, bem como outros componentes complexos desconhecidos, que são difíceis de extrair.
- A minha amostra é uma célula, o que preciso de fazer antes de realizar a entrega do RIP-Seq?
- 1. As células em cultura em parede devem ser processadas em suspensão celular e lavadas duas vezes com tampão PBS (preparado sem Rnase), centrifugadas a 3.000 rpm/min, a 4 °C durante 5 min, o sobrenadante deve ser descartado e rotulado com precisão.
2. Congelar rapidamente em azoto líquido durante 30 minutos, depois transferir para -80 °C ou armazenar em azoto líquido.
3. Transporte: coloque os tubos liofilizados em tubos de centrífuga de 50 ml ou em pequenos sacos plásticos com boa vedação e transporte em gelo seco.
4. Tamanho da amostra: 1 x 108.
- 1. As células em cultura em parede devem ser processadas em suspensão celular e lavadas duas vezes com tampão PBS (preparado sem Rnase), centrifugadas a 3.000 rpm/min, a 4 °C durante 5 min, o sobrenadante deve ser descartado e rotulado com precisão.
Apenas para fins de investigação, não se destina a diagnóstico clínico, tratamento ou avaliações de saúde individuais.
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