Protocolo de Perfilagem de Ribossomas

Introdução ao Profiling de Ribossomas

Perfilagem de ribossomas, comumente referido como Ribo-Seq, é uma técnica poderosa utilizada na investigação da tradução, o intricado processo através do qual os ribossomas orquestram a síntese de proteínas a partir de moldes de mRNA. Este método de ponta oferece uma visão das posições dos ribossomas ao longo dos mRNAs, permitindo que os cientistas analisem o estado de tradução de mRNAs individuais e avaliem a sua eficiência. Perfilagem de ribossomas abrange a captura e sequenciação de fragmentos de mRNA protegidos por ribossomas. Rotulados como pegadas protegidas por ribossomas (RPFs), estes fragmentos delineiam as localizações precisas dos ribossomas nos mRNAs, oferecendo informações valiosas sobre a dinâmica da tradução. O objetivo principal é quantificar e mapear a presença de ribossomas ao longo do transcriptoma, revelando, em última análise, os genes que estão ativamente a passar por tradução e a velocidade com que este processo se desenrola.

O protocolo detalhado para Perfilagem de Ribossomas é o seguinte:

Perfilagem de Ribossomas Preparação da Biblioteca

Fracionamento Citosólico

Extraia a fração citosólica (volume final de 600 μL), utilizando o tampão de lise hipotónico sem Inibidor de RNase. Mantenha a 4 °C na câmara fria para evitar a degradação indesejada de mRNA durante o processo.

Pé de RNase I e Recuperação de Ribossomas

1. Pegue 600 μL da fração citosólica e adicione 7,5 μL de RNase I (100 U/μL).
2. Incubar durante 45 minutos à temperatura ambiente com agitação suave no nutador.
3. Para parar a digestão com RNase I, adicione 10 μL de SUPERase Inhibitor e bata suavemente nos tubos.
4. Executar 15-45% de sacarose e confirmar a digestão eficiente da RNase I.
5. Colete e combine as frações 6, 7 e 8. As frações 9-10 incluem fragmentos de mRNA protegidos por disoma que podem representar paragem do ribossoma e estão excluídas da nossa análise.
6. Adicione 4,5 mL de Trizol-LS às frações combinadas (total de 6 mL) e extraia o RNA total.

Purificação em Gel Footprint

1. Adicione 2× tampão de carregamento desnaturalizante a cada amostra.
2. Prepare 1 μL de marcador de RNA de 26 nt e 34 nt e 1 μL de escada de DNA de 10 bp como controlo. Adicione 4 μL de Tris-HCl 10 mM (pH 8.0) e 5 μL de tampão de carregamento desnaturalizante 2× a cada um.
3. Desnaturalize a amostra a 80 °C durante 90 s e transfira a amostra diretamente para gelo.
4. Separe a amostra utilizando um gel de poliacrilamida TBE-Urea a 10% em tampão TBE 0,5× com potência constante (5 W) durante 80 minutos, até que o corante bromofenol azul atinja dois terços do gel. Lavar cada poço com solução TBE 0,5× com seringa antes da carga da amostra ajuda a gerar bandas bem definidas.
5. Desmonte cuidadosamente a cassete de gel e manche o gel durante 3 minutos com 1× SYBR gold em tampão 0,5× TBE.
6. Exclua a pegada do ribossoma (região de 24-36 nt) e o marcador de 26 nt/34 nt. As pegadas de 26 nt/34 nt extraídas aqui servem como controlo para os passos restantes.
7. Extração de gel durante a noite. Adicione 400 μL de tampão de extração de gel de RNA e congele a amostra durante 30 minutos em gelo seco. Deixe a amostra durante a noite (15 horas é o recomendado) com agitação suave. Colete toda a solução e transfira para eppitubes não aderentes e livres de RNase. Precipite as impressões digitais adicionando 2 μL de Glycoblue e 500 μL de isopropanol. Realize a precipitação durante 30 minutos ou mais em gelo seco. Centrifugue à velocidade máxima a 4 °C durante 30 minutos utilizando uma centrífuga de bancada. As impressões digitais frequentemente acabam nas laterais dos tubos. Se isso acontecer, ressuspenda as impressões digitais e centrifugue novamente. Remova completamente o sobrenadante e deixe secar ao ar durante 5 minutos. Dissolva as impressões digitais em 10 μL de água livre de RNase.

Depleção de rRNA Ribo-Zero

1. Realize a remoção de rRNA utilizando o kit de remoção de rRNA Ribo-zero, seguindo o protocolo do fabricante.
2. Concentre a amostra sem rRNA de acordo com o protocolo do fabricante do kit. Na etapa final de eluição, utilize 8 μL de água livre de RNase, o que resultará em 7 μL de eluído final.

Desfosforilação, Ligação de Ligadores e Purificação de Produtos Ligados por Ligadores

1. Reação de desfosforilação. Misture 7 μL de footprint desprovido de rRNA e 1 μL de tampão PNK. Incube a 75 °C durante 1 min e arrefeça em gelo. Adicione 1 μL de Inibidor SUPERase e 1 μL de T4 PNK. Incube durante 1 h a 37 °C (volume total: 10 μL). Após a conclusão, inative as amostras por aquecimento a 65 °C durante 3 min e arrefeça as amostras em gelo.
2. Reação de ligação de ligador. Misture 10 μL de produtos desfosforilados e 1 μL de ligador-1. Desnaturar a amostra durante 90 s a 80 °C e imediatamente arrefecer em gelo durante 10 min. Adicione 1 μL de tampão T4 Rnl2, 1 μL de inibidor SUPERase, 6 μL de PEG8000 e 1 μL de ligase de RNA T4 2 (truncada). Incubar durante 3 h a 25 °C.
3. Adicione 30 μL de água livre de RNase a cada amostra e purifique o produto ligado utilizando o kit Zymo RNA Clean and Concentrator-5. Note que o kit remove eficientemente o ligador não ligado. Na etapa final, elua o produto ligado em 11 μL de solução de Tris-HCl 10 mM (pH 8.0). O eluído final é de -10 μL.

Transcrição Reversa e Circularização

1. Adicione 2 μL de primer de transcrição reversa a 0,25 μM a 10 μL do produto ligado por ligadura.
2. Desnaturalize a amostra durante 2 minutos a 80 °C e arrefeça imediatamente em gelo.
3. Adicione 8 μL de mistura mestre de transcrição reversa a cada amostra para fazer uma reação de 20 μL.
4. Hidrolize o template de RNA adicionando 2,2 μL de NaOH 1 N e incube a 90 °C durante 20 minutos.
5. Precipitar o produto da RT. Adicione 20 μL de acetato de sódio 3 M (pH 5,5), 2 μL de Glycoblue, 156 μL de água destilada, 300 μL de isopropanol e precipite em gelo seco durante 30 min. Pelote o DNA durante 30 min conforme descrito e ressuspenda o produto da RT em 10 μL de água destilada.
6. Prepare 2 μL de primer RT a 0,25 μM (misturado com 3 μL de Tris-HCl 10 nM, pH 8,0 e 5 μL de tampão de carregamento desnaturalizante 2×) e 1 μL de escada de DNA de 10 bp como controlo. Adicione 10 μL de tampão de carregamento 2× a cada amostra. Desnaturalize a amostra a 80 °C durante 90 s e arrefeça imediatamente em gelo.
7. Separe a amostra utilizando um gel de poliacrilamida TBE-Urea a 7,5% em tampão TBE 0,5× com potência constante (5 W) durante 1 h e 30 min, até que o corante bromofenol azul atinja o final do gel.
8. Excisar o produto de transcrição reversa e transferi-lo para tubos eppi não adesivos. Tubos de 2 mL são recomendados para a extração de DNA. Evite qualquer contaminação do primer RT não estendido.
9. Extração de gel durante a noite. Adicione 400 μL de tampão de extração de gel de DNA e congele a amostra durante 30 minutos em gelo seco. Deixe a amostra durante a noite (15 horas é o recomendado) com agitação suave. Colete toda a solução e transfira-a para tubos não aderentes e livres de RNase. Precipite as pegadas adicionando 2 μL de Glycoblue e 500 μL de isopropanol. Realize a precipitação durante 30 minutos ou mais em gelo seco. Centrifugue à máxima velocidade a 4 °C durante 30 minutos utilizando uma centrífuga de bancada. Remova completamente o sobrenadante e deixe secar ao ar durante 5 minutos. Dissolva a pegada em 15 μL de Tris-HCl 10 mM (pH 8.0).
10. Misture 15 μL do produto extraído do gel, 2 μL do tampão CircLigase, 1 μL de ATP a 1 mM, 1 μL de MnCl2 a 10 nM e 1 μL de CircLigase por amostra, incube a reação durante 1 h a 60 °C e inative o calor durante 10 min a 80 °C.
11. Recupere o produto final de DNA. Adicione 74 μL de água destilada, 6 μL de NaCl 5 M, 2 μL de Glycoblue e 150 μL de isopropanol e precipite o DNA.
12. Resuspenda o produto de DNA circularizado em 5 μL de 10 mM Tris-HCl (pH 8.0).

Geração de Biblioteca Indexada

1. Amplificação por PCR de biblioteca circularizada usando a polimerase Phusion de acordo com as instruções do fabricante. Realize vários ciclos diferentes para comparação. Utilize diferentes primers reversos com código de barras para diferentes amostras com um único primer direto.
2. Adicione 6× corante de carregamento de DNA a cada produto de PCR e prepare 1 μL de escada de DNA de 10 bp como controlo.
3. Separe os produtos de PCR utilizando um gel de poliacrilamida TBE a 8%, durante 90 minutos a 180 V em tampão TBE a 0,5×, ou até que o corante bromofenol azul atinja dois terços do gel.
4. Tinge o gel durante 3 minutos em 1× SYBR Gold em tampão 0,5× TBE.
5. Excise o produto de PCR de ~175 nt do gel e exclua cuidadosamente a banda borrada que migra lentamente (acima de 200 nt), as bandas da transcrição reversa não estendida (~145 nt), o molde e o primer (menos de 100 nt).
6. Extração de gel durante a noite. Adicione 400 μL de tampão de extração de gel de DNA e congele a amostra durante 30 minutos em gelo seco. Deixe a amostra durante a noite (15 horas é recomendado) com agitação suave. Colete toda a solução e transfira-a para eppitubes não aderentes e livres de RNase. Precipite as pegadas adicionando 2 μL de Glycoblue e 500 μL de isopropanol. Realize a precipitação durante 30 minutos ou mais em gelo seco. Centrifugue à velocidade máxima a 4 °C durante 30 minutos utilizando uma centrífuga de bancada. Remova completamente o sobrenadante e deixe secar ao ar durante 5 minutos. Dissolva a pegada em 15 μL de Tris-HCl 10 mM (pH 8.0).
7. Meça a concentração de DNA e combine quantidades iguais de cada amostra para sequenciação Illumina.

Sequenciação com Plataformas Illumina

Este protocolo resulta numa biblioteca de sequenciação totalmente funcional compatível com Illumina. HiSeq, MiSeqe NextSeq plataformas de sequenciação. O utilizador deve seguir os procedimentos padrão recomendados pela Illumina para ajustar a concentração final da biblioteca para carregamento numa célula de fluxo Illumina e sequenciação apropriada para o sequenciador utilizado.

Conclusão

Perfilagem de ribossomas fornece uma visão de alta resolução e abrangente da tradução ao mapear precisamente as localizações dos ribossomas nos RNAs mensageiros (mRNAs). Esta técnica serve como uma ferramenta robusta para analisar quantitativamente os padrões de expressão génica, descobrir novos fenómenos de tradução e examinar a dinâmica da síntese de proteínas. A capacidade única de perfilagem de ribossomas monitorizar a tradução em tempo real, enquanto fornece informações quantitativas precisas sobre a abundância e eficácia dos ribossomas, torna-o um ativo essencial para investigações em genómica funcional, regulação da tradução e modulação da expressão génica em diversas circunstâncias biológicas.

Referência:

1. Jin H Y, Xiao C. Um método integrado de perfilagem de polissomas e perfilagem de ribossomas para investigar o translatoma in vivo // Sequenciação de Nova Geração. Humana Press, Nova Iorque, NY, 2018: 1-18.