Como Estudar a Regulação Transcricional de circRNA

ARNs circulares (circARNs) modular a expressão de genes-alvo através de vários mecanismos, incluindo servir como esponjas de microRNA (miRNA) para influenciar a estabilidade e a tradução do RNA, interagir com proteínas para regular as suas funções, codificar proteínas e interagir com o DNA ou fatores de transcrição para controlar a transcrição. Este artigo explora os mecanismos pelos quais as circRNAs influenciam a transcrição.

Mecanismos de Regulação Transcricional Mediados por circRNA

A região promotora é uma das áreas mais amplamente investigadas na regulação transcricional. As circRNAs podem influenciar a transcrição dos seus genes hospedeiros de forma positiva ou negativa. Esta regulação é alcançada através da interação com a RNA polimerase II (Pol II), recrutando proteínas ou formando R-loops nas regiões regulatórias transcricionais dos seus genes-alvo.

Figura 1 As circRNAs regulam a expressão gênica do hospedeiro a nível transcricional.

Interacção com a Pol II para Aumentar a Transcrição de Genes Hospedeiros

A melhoria da atividade transcricional dos genes hospedeiros facilitada pela polimerase II envolve ciRNAs intrónicos específicos, nomeadamente ci-ankrd52, ci-mcm5 e ci-sirt7. Estes ciRNAs estão predominantemente localizados nos locais de transcrição dos seus genes hospedeiros, que coincidem com regiões associadas à elongação da transcrição mediada pela RNA Polimerase II. Atuando como reguladores transcricionais positivos, eles aumentam significativamente os níveis de expressão dos seus genes hospedeiros.

Além disso, dois RNAs circulares exónicos-intrónicos (EIciRNAs), circEIF3J e circPAIP2, interagem com a RNA Polimerase II, U1 snRNP e os promotores dos seus genes hospedeiros. Através da formação de ciclos de feedback positivo de forma cis-ativa, estes EIciRNAs aumentam ainda mais os níveis de transcrição dos seus respetivos genes hospedeiros.

A Recrutamento de Proteínas que Modulam a Expressão Génica do Hospedeiro

Certos circRNAs possuem locais de ligação a proteínas altamente específicos, permitindo-lhes funcionar como iscas de proteínas, andaimes ou recrutadores. Ao atrair uma ou várias proteínas para regiões específicas de promotores-alvo, esses circRNAs podem modular a ativação transcricional e a expressão de genes hospedeiros. Os tipos de proteínas recrutadas incluem proteínas de ligação ao RNA (RBPs), desmetilases de DNA e metiltransferases de DNA.

Ativação da Transcrição de Genes Hospedeiros através da Recrutamento de Proteínas

Por exemplo, o circ-CUX1 pode ligar-se à proteína de ligação ao RNA EWS (EWSR1), facilitando a interação do EWSR1 com a proteína de dedo de zinco associada ao MYC (MAZ). Esta interação induz a ativação transcricional do MAZ, regulando assim a transcrição do gene hospedeiro CUX1 e de outros genes relacionados. Este mecanismo regulatório promove a glicólise aeróbica e a progressão maligna do neuroblastoma.

Outro exemplo é o circRNA FECR1, que recruta a desmetilase de DNA TET1 para o promotor do seu gene hospedeiro FLI1, induzindo a desmetilação do DNA. Além disso, o circRNA FECR1 liga-se e regula negativamente a metiltransferase de DNA DNMT1, resultando em hipometilação das ilhas CpG do promotor e ativação da transcrição de FLI1. Este processo aumenta a capacidade invasiva das células do câncer de mama.

Inibição da Transcrição de Genes do Hospedeiro Através da Sequestro de RBP

circ-HUR exemplifica a função inibitória dos circRNAs. Ele interage com o domínio RGG da proteína de ligação a ácidos nucleicos do tipo dedo de zinco CCHC (CNBP), impedindo que o CNBP se ligue ao promotor do HuR. Esta interação inibe a transcrição do HuR, levando à downregulação do seu gene hospedeiro HuR. Como resultado, o crescimento e a invasividade do câncer gástrico são suprimidos tanto in vitro como in vivo.

Regulação da Expressão Génica do Hospedeiro através da Formação de R-loops

Um R-loop é uma estrutura de cromatina especializada composta por um híbrido de RNA-DNA e DNA de cadeia simples deslocado. Os R-loops frequentemente se formam como resultado da paragem da RNA polimerase ou de defeitos na biogénese do RNA. Estas estruturas podem interferir com a replicação, reparação e transcrição do DNA. Os circRNAs podem aumentar a eficiência de splicing de mRNA deficientes em exões homólogas ao hibridizar com DNA ou formar R-loops. Isto não só afeta a abundância de transcritos lineares, mas também cria armadilhas de mRNA, pausando a transcrição e melhorando o recrutamento de fatores de splicing.

Em resumo, as circRNAs desempenham papéis versáteis na regulação da expressão gênica do hospedeiro através da recrutamento de proteínas, absorção de RBPs e formação de R-loops. A sua capacidade de modular processos epigenéticos e transcricionais chave sublinha a sua importância na tumorigenese e apresenta novas oportunidades terapêuticas para o tratamento de malignidades.

Investigação da Regulação Transcricional do circRNA: Um Estudo de Caso

Contexto e Antecedentes

O estudo em discussão, publicado na Molecular Cancer, uma revista altamente respeitada com um fator de impacto significativo, investiga os mecanismos moleculares subjacentes à resistência à gemcitabina (GEM) no adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). Esta resistência representa um desafio crítico na gestão terapêutica do PDAC, uma malignidade notoriamente agressiva com opções de tratamento limitadas. Em particular, o foco está na circRNA, que tem atraído uma atenção substancial nos últimos anos devido ao seu envolvimento na progressão do câncer, quimiorresistência e funções regulatórias a níveis transcricional e pós-transcricional.

Neste estudo, hsa_circ_0007919 é identificado como um jogador chave na resistência ao GEM através da sua modulação da resposta ao dano do DNA (DDR) e das vias de reparo. A regulação positiva de hsa_circ_0007919 em tecidos de PDAC resistentes ao GEM sugere um papel funcional na manutenção da sobrevivência celular sob stress quimioterápico. A investigação descreve como hsa_circ_0007919 recruta fatores de transcrição como FOXA1 e TET1, impulsionando a expressão de LIG1 (Ligase I), um gene integral aos mecanismos de reparo do DNA. O estudo enfatiza a importância deste eixo regulatório em permitir que as células de PDAC evitem a apoptose e sustentem a proliferação, apesar do dano ao DNA induzido pelo GEM.

Desenho do Estudo e Metodologia

O estudo empregou uma abordagem multifacetada para elucidar o papel do hsa_circ_0007919 na regulação transcricional do LIG1, utilizando tecnologias e desenhos experimentais de última geração:

Sequenciação de Nova Geração (NGS)A triagem inicial através de sequenciação de RNA revelou uma notável upregulação de hsa_circ_0007919 em tecidos e linhas celulares de PDAC resistentes ao GEM, fornecendo uma base para análises funcionais subsequentes.

Ensaios CelularesForam realizados ensaios funcionais para avaliar o impacto do hsa_circ_0007919 na proliferação celular, apoptose e sensibilidade ao GEM. O silenciamento do hsa_circ_0007919 reduziu a sobrevivência celular e aumentou a quimiosensibilidade, enquanto a sua superexpressão conferiu resistência.

Sequenciação de RNA (RNA-seq)A análise correlacional entre os níveis de expressão de hsa_circ_0007919 e LIG1 foi realizada, estabelecendo uma associação positiva. Isso sugeriu que hsa_circ_0007919 aumenta a transcrição de LIG1, promovendo assim a resistência ao GEM através de uma atividade de reparo de DNA aumentada.

Ativação da Via de Resposta ao Dano no DNADados experimentais indicaram que hsa_circ_0007919 induz a expressão de LIG1, levando à ativação das vias de DDR, incluindo reparo por excisão de bases (BER), reparo de desajustes (MMR) e reparo por excisão de nucleotídeos (NER). Isso facilitou o reparo eficiente das lesões de DNA induzidas por GEM, sustentando assim a viabilidade das células de PDAC.

Estudos de Localização Subcelular (AH-FISH/Fração Nuclear-Citosólica): A hibridização in situ por fluorescência (FISH) e os ensaios de fração nuclear-citosólica demonstraram que hsa_circ_0007919 está predominantemente localizado no núcleo, reforçando o seu papel na regulação transcricional.

Predições de Interações de Proteínas e Análise de Bases de DadosBancos de dados como circAtlas, STRING e SPP foram utilizados para prever interações potenciais entre hsa_circ_0007919, FOXA1, TET1 e o promotor do LIG1. Estas análises forneceram uma base bioinformática para experimentos de validação adicionais.

Co-Imunoprecipitação (Co-IP) e Ensaios RIP/ChIRPA FOXA1 e a TET1 demonstraram interagir fisicamente, como demonstrado por experimentos de Co-IP. Ensaios de RIP e ChIRP confirmaram que a hsa_circ_0007919 se liga tanto à FOXA1 como à TET1, sugerindo um papel direto na recrutaçã destes fatores para o promotor do LIG1.

Metilação de Ilhas CpG e Ligação de Fatores de TranscriçãoUsando o JASPAR e o MethPrimer 2.0, o estudo previu a ligação do FOXA1 a ilhas CpG no promotor do LIG1. Ensaios de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) verificou a ligação de FOXA1 e TET1 à região de -1273 a -1411 do promotor do LIG1, correlacionando-se com a diminuição da metilação do promotor e o aumento da ativação transcricional.

Ensaios de Reporter de LuciferasePara confirmar a ativação transcricional do LIG1, foram utilizados construtos reportadores de luciferase contendo o promotor do LIG1. Os resultados demonstraram que o hsa_circ_0007919, em conjunto com o FOXA1 e o TET1, aumentou significativamente a atividade do promotor do LIG1.

A partir das ideias de pesquisa acima, pode-se ver que as tecnologias mais críticas para estudando a regulação transcricional de circRNA ou outro RNA (como lncRNA) são os seguintes:

Figura 2 Tecnologias para estudar a regulação transcricional de circRNA

Conclusões e Implicações

Os resultados deste estudo sublinham o papel crítico do hsa_circ_0007919 na modulação da resistência ao GEM no PDAC, regulando a ativação transcricional do LIG1 através da sua interação com o FOXA1 e o TET1. Ao reduzir a metilação do promotor do LIG1, o hsa_circ_0007919 facilita a upregulação das vias de reparação do DNA, permitindo assim que as células cancerígenas resistam à citotoxicidade induzida pela quimioterapia.

Estes resultados fornecem informações significativas sobre os mecanismos moleculares da resistência à quimioterapia e sugerem que a abordagem do eixo hsa_circ_0007919-FOXA1-TET1-LIG1 pode representar uma nova estratégia terapêutica para superar a resistência ao GEM no PDAC. Além disso, este estudo destaca técnicas e abordagens chave—como NGS, ChIP e ensaios de reporter de luciferase—que são fundamentais para explorar a regulação transcricional de circRNAs e outros RNAs não codificantes.

Esta pesquisa também abre caminhos para investigações adicionais sobre o papel mais amplo dos circRNAs na regulação transcricional, nos mecanismos de reparação do DNA e na quimiorresistência do câncer. A integração de técnicas moleculares avançadas, incluindo edição genómica baseada em CRISPR, pode esclarecer ainda mais a relevância funcional das redes transcricionais impulsionadas por circRNA na oncogénese e na resistência à terapia.

Em conclusão, este estudo exemplifica uma abordagem abrangente para compreender as complexidades moleculares da quimiorresistência, estabelecendo as bases para futuros desenvolvimentos terapêuticos destinados a melhorar a eficácia dos regimes quimioterapêuticos no PDAC e em outros tipos de câncer caracterizados pela resistência às terapias convencionais.

Referências:

1. Wei J, et al. Compreender os papéis e padrões de regulação do circRNA no seu gene hospedeiro na tumorigénese e progressão tumoral. J Exp Clin Cancer Res2023;42(1):86.
2. Zhang Y, et al. RNAs longos não codificantes intrónicos circulares. Mol Cell. 2013;51(6):792-806.
3. Li Z, et al. Os RNAs circulares exon-intrão regulam a transcrição no núcleo. Nat Struct Mol Biol. 2015;22(3):256-64.
4. Li H, et al. Atingir terapeuticamente o eixo circCUX1/EWSR1/MAZ inibe a glicólise e a progressão do neuroblastoma. EMBO Mol Med. 2019;11(12):e10835.
5. Chen N, et al. Um novo RNA circular exónico FLI1 promove a metastização no câncer de mama ao regular coordenadamente TET1 e DNMT1. Genome Biol. 2018;19(1):218.
6. Yang F, et al. Circ-HuR suprime a expressão de HuR e a progressão do câncer gástrico ao inibir a transativação de CNBP. Mol Cancro. 2019;18(1):158.
7. Xu L, et al. hsa_circ_0007919 induz a transcrição de LIG1 ao ligar-se a FOXA1/TET1 para aumentar a resposta ao dano do DNA e promover a resistência à gemcitabina no adenocarcinoma ductal pancreático. Câncer Mol.2023;22(1):195.