Abundância Absoluta vs Abundância Relativa no Microbioma

Na pesquisa do microbioma (incluindo metagenómica e Sequenciação do rRNA 16S), os termos abundância absoluta e abundância relativa são frequentemente encontrados. No entanto, o que exatamente significam estes termos e por que é importante diferenciá-los?

O que é Abundância Relativa?

A abundância relativa refere-se à proporção de um microorganismo específico dentro de toda a comunidade microbiana. Em outras palavras, não fornece o número real de microorganismos, mas indica a proporção desse microorganismo em relação ao total de microorganismos. A soma das abundâncias relativas geralmente equivale a 100% (ou 1).

Exemplo:

Assuma que, numa amostra, um total de 300.000 bactérias é detetado, sendo 100.000 da espécie A e 200.000 da espécie B. A abundância relativa pode ser calculada da seguinte forma:

• Abundância relativa da espécie A = 100.000 / 300.000 = 33,33%
• Abundância relativa da espécie B = 200.000 / 300.000 = 66,67%

A abundância relativa é relativamente simples de calcular e, uma vez que está normalizada em relação ao total de microrganismos, não é afetada pelo tamanho total da amostra. Técnicas de sequenciação de alto rendimento, como a sequenciação do rRNA 16S, são comumente utilizadas para obter dados de abundância relativa.

O que é Abundância Absoluta?

A abundância absoluta refere-se ao número real de um microorganismo específico presente numa amostra. Normalmente é quantificada como o "número de células microbianas por grama/mililitro de amostra." Esta medida informa-nos diretamente sobre a quantidade real de microorganismos na amostra.

Exemplo:

Numa amostra de água, supõe-se que são detetadas 100.000 bactérias da espécie A e 200.000 bactérias da espécie B. A abundância absoluta da espécie A é de 100.000 células, e para a espécie B, é de 200.000 células.

Os dados de abundância absoluta são geralmente obtidos através de técnicas quantitativas, como a PCR quantitativa (qPCR), que requerem passos experimentais adicionais e ferramentas de medição precisas.

Principais Diferenças Entre Abundância Absoluta e Abundância Relativa

As principais diferenças entre abundância absoluta e abundância relativa são as seguintes:

• Abundância absoluta fornece a contagem real de microrganismos, que reflete o verdadeiro número de micróbios na amostra.
• Abundância relativa descreve a relação proporcional entre diferentes microrganismos dentro de uma amostra, permitindo a comparação das suas distribuições relativas.

No entanto, uma limitação da abundância relativa é que pode não refletir com precisão as verdadeiras alterações na abundância de um microrganismo quando o tamanho total da amostra varia. Por exemplo, se os números das espécies A e B diminuírem proporcionalmente, a abundância relativa pode permanecer inalterada, mesmo que o número real desses microrganismos tenha diminuído. Em contrapartida, a abundância absoluta revelaria a diminuição real no número de microrganismos.

Figura 1. A distinção entre abundâncias absolutas e abundâncias relativas (Huang Lin) et al.., 2020)

Quando Usar Abundância Absoluta e Quando Usar Abundância Relativa?

Abundância absolutaSe o objetivo é determinar o número real de microrganismos (como na monitorização de doenças ou na quantificação precisa da carga microbiana), a abundância absoluta é mais fiável.

Abundância relativaSe o foco estiver em compreender a estrutura da comunidade e comparar as proporções de diferentes microrganismos dentro de uma amostra (como em estudos ecológicos de populações microbianas), a abundância relativa é frequentemente preferida. Esta abordagem destaca as relações proporcionais entre os microrganismos dentro da comunidade.

Ao compreender estas duas abordagens diferentes, os investigadores podem selecionar o método apropriado para os seus objetivos de estudo específicos, garantindo que os dados obtidos fornecem informações significativas e precisas sobre o microbioma.

Abundância Absoluta e Relativa na Sequenciação de 16S rRNA

A sequenciação do rRNA 16S é uma técnica amplamente utilizada para analisar a estrutura da comunidade microbiana. Funciona amplificando o gene 16S rRNA de bactérias e arqueias, que ajuda a identificar os tipos de microrganismos presentes numa amostra.

Na sequenciação de 16S, a abundância relativa é comumente utilizada. Isto deve-se ao facto de que os resultados da sequenciação normalmente fornecem as leituras de sequência para cada táxon bacteriano (por exemplo, unidades taxonómicas operacionais (OTUs) ou variantes de sequência de amplicão (ASVs)), em vez da quantidade real de organismos. Variações na profundidade e eficiência da sequenciação podem influenciar o número total de sequências entre diferentes amostras, levando à conversão das contagens de sequência em abundância relativa para comparação entre amostras.

Abundância Absoluta na Sequenciação 16S

Para determinar a abundância absoluta na sequenciação do rRNA 16S, são necessários métodos adicionais, como qPCR ou citometria de fluxo, para quantificar a carga microbiana total na amostra. A abundância absoluta de cada espécie microbiana pode então ser calculada multiplicando a abundância relativa pela quantidade microbiana total.

Exemplo:

Se a qPCR revelar que a contagem total de bactérias numa amostra é de 1 milhão, e a abundância relativa da espécie A é de 20%, a abundância absoluta da espécie A seria:

Figura 2. A fórmula para calcular a abundância absoluta

Resumo

Na sequenciação de 16S, a abundância relativa é o método principal de análise porque elimina a variabilidade causada por diferenças na profundidade de sequenciação. Se a abundância absoluta for necessária, técnicas quantitativas devem ser incorporadas para complementar os dados.

Abundância Absoluta e Relativa em Sequenciação Metagenómica

Sequenciação metagenómica envolve diretamente a sequenciação dos genomas de todos os microrganismos presentes numa amostra, proporcionando uma análise mais abrangente. Este método permite a deteção de bactérias, fungos, vírus e outras informações genéticas microbianas. A sequenciação metagenómica oferece uma maior resolução e permite insights diretos sobre as características funcionais microbianas.

Semelhante ao sequenciamento de rRNA 16S, o sequenciamento metagenómico utiliza tipicamente a abundância relativa para a análise de dados. Isto deve-se ao facto de que o número total de leituras de sequências no sequenciamento metagenómico pode ser influenciado pela profundidade de sequenciamento, levando a variações significativas no número total de leituras entre amostras. Portanto, o uso da abundância relativa garante comparabilidade entre as amostras.

Abundância Absoluta em Metagenómica

Para determinar a abundância absoluta de cada espécie microbiana em sequenciação metagenómica, são necessários dados de abundância microbiana total para a amostra. Tal como na sequenciação do rRNA 16S, métodos como qPCR ou outras técnicas quantitativas podem ser utilizados para estimar a carga microbiana total. A abundância absoluta de cada microrganismo pode então ser calculada multiplicando a abundância relativa pela abundância total estimada.

Metagenómica vs. Sequenciação de 16S rRNA: Métricas de Abundância

Sequenciação do rRNA 16SEste método é mais adequado para avaliar rapidamente a composição e as alterações nas comunidades microbianas, especialmente quando existem restrições orçamentais. O cálculo da abundância relativa é simples; no entanto, a resolução é limitada devido ao sequenciamento de apenas um fragmento específico do gene 16S, tornando difícil obter contagens absolutas precisas.

Sequenciação MetagenómicaEsta abordagem captura uma gama mais ampla de táxons microbianos, incluindo bactérias, vírus, fungos e outros organismos, ao mesmo tempo que fornece uma análise mais aprofundada das características funcionais microbianas. Embora o sequenciamento metagenómico seja mais dispendioso, oferece informações mais ricas, incluindo funções genéticas e papéis ecológicos. Tal como o sequenciamento de 16S rRNA, o sequenciamento metagenómico baseia-se principalmente na análise de abundância relativa, a menos que seja complementado com técnicas quantitativas para derivar a abundância absoluta.

Conversão entre Abundância Absoluta e Relativa

Converter Abundância Absoluta em Abundância Relativa

É simples converter a abundância absoluta em abundância relativa, dividindo a abundância absoluta de cada espécie pela abundância absoluta total de todas as espécies na amostra.

Fórmula:

Figura 3. A fórmula para converter Abundância Absoluta em Abundância Relativa

Para converter a abundância relativa em abundância absoluta, é necessário conhecer a abundância microbiana total na amostra. A abundância absoluta pode então ser calculada multiplicando a abundância relativa pela abundância microbiana total.

Fórmula:

Figura 4. A fórmula para converter abundância relativa em abundância absoluta.

Ao compreender estes métodos de cálculo e conversão de abundância, os investigadores podem selecionar a abordagem adequada para o seu desenho experimental específico, garantindo a precisão e comparabilidade dos dados da comunidade microbiana em vários tipos de estudo.

Exemplo de Código para Converter Dados de Abundância em Sequenciação de 16S rRNA ou Metagenómica Usando R

Tanto na sequenciação de 16S rRNA como na sequenciação metagenómica, a abordagem fundamental para calcular a abundância relativa e absoluta permanece consistente. Abaixo está um exemplo que demonstra como realizar estas conversões em R:

1. Converter a Abundância Absoluta em Abundância Relativa em Sequenciação de 16S rRNA ou Metagenómica

Suponha que temos dados de abundância absoluta para uma amostra, onde cada linha representa uma amostra e cada coluna corresponde a um microorganismo diferente:

# Dados de abundância absoluta (linhas = amostras, colunas = microrganismos)

abundância_absoluta <- matriz(c(500, 1000, 200,

800, 400, 600
300, 500, 900),
nrow = 3, por linha = VERDADEIRO)

# Calcular a abundância total para cada amostra
total_abundance <- rowSums(abundância_absoluta)

# Calcular abundância relativa
abundância_relativa <- abundância_absoluta / abundância_total

# Matriz de abundância relativa
abundância_relativa

2. Converter Abundância Relativa em Abundância Absoluta (Requer Abundância Total da Amostra)

Suponha que temos uma matriz de abundância relativa e que a abundância microbiana total de cada amostra é conhecida (obtida através de métodos como qPCR):

# Matriz de abundância relativa (linhas = amostras, colunas = microrganismos)
abundância_relativa <- matriz(c(0.2, 0.4, 0.1,

0,4, 0,2, 0,3,
0,3, 0,25, 0,45),
nrow = 3, por linha = VERDADEIRO)

# Abundância microbiana total por amostra (obtida através de qPCR ou métodos semelhantes)
abundância_total <- c(1000, 1500, 2000)

# Calcular abundância absoluta
abundância_absoluta <- abundância_relativa * abundância_total

# Saída da matriz de abundância absoluta
abundância_absoluta

As leituras da alinhamento são consideradas abundância absoluta?

O número de leituras obtidas a partir do alinhamento de sequências não pode ser diretamente igualado à abundância absoluta. Em vez disso, essas leituras representam as contagens de sequências para um determinado microrganismo numa amostra. Este valor não corresponde à quantidade microbiana real (abundância absoluta) devido a vários fatores influentes, incluindo:

1. Profundidade de SequenciamentoA amostras diferentes podem ter profundidades de sequenciação variadas, o que afeta o número de leituras geradas. Amostras com maior profundidade de sequenciação produzirão mais leituras.
2. Viés de Amplificação por PCREm técnicas de sequenciação baseadas em amplificação (por exemplo, sequenciação de 16S rRNA), certos fragmentos de genes microbianos podem ser amplificados de forma preferencial, levando a uma sobre-representação de certos táxons e a potenciais erros na estimativa de abundância relativa.
3. Tamanho do GenomaNa sequenciação metagenómica, o tamanho do genoma de diferentes microrganismos pode variar significativamente. Microrganismos com genomas maiores são propensos a produzir mais leituras do que aqueles com genomas menores.

Assim, o número de leituras é geralmente considerado uma aproximação da abundância relativa, refletindo a "presença relativa" de um microrganismo na comunidade microbiana após a sequenciação.

Para converter contagens de leitura em abundância absoluta, são necessários passos quantitativos adicionais. Por exemplo, métodos como qPCR ou citometria de fluxo podem ser utilizados para determinar a abundância microbiana total na amostra. Uma vez conhecida a abundância total, a abundância absoluta de cada microrganismo pode ser calculada combinando estes dados com as contagens de leitura.

Fórmula de Conversão:

A fórmula seguinte permite a conversão de dados de sequenciação relativa em quantidades microbianas reais, permitindo assim o cálculo da abundância absoluta:

Figura 5. A fórmula para converter a contagem de leituras em abundância absoluta

A Importância da Quantificação Absoluta na Pesquisa do Microbioma

Um número crescente de evidências sugere que medir a abundância absoluta de microrganismos pode fornecer dados mais abrangentes em comparação com a quantificação relativa, oferecendo a possibilidade de corrigir certas conclusões erróneas derivadas de dados de abundância relativa. Além disso, os vieses experimentais introduzidos durante o processamento de amostras podem afetar significativamente a medição precisa da composição do microbioma. Avaliações sistemáticas dos métodos de preservação de amostras e do impacto de diferentes temperaturas de armazenamento nas comunidades microbianas são necessárias para compreender melhor as fontes de vieses analíticos. No entanto, a literatura existente apresenta conclusões inconsistentes sobre este assunto, destacando a necessidade de uma investigação mais aprofundada para esclarecer essas discrepâncias.

A incorporação da quantificação absoluta na avaliação de amostras de microbioma pode melhorar a precisão das medições da abundância microbiana. Esta abordagem é crítica para identificar e abordar viéses sistemáticos resultantes de variações nas condições experimentais, como diferenças nas soluções de preservação de amostras e temperaturas de armazenamento. O recente estudo publicado na Nature Biotechnology, intitulado Quantificação do Viés Introduzido pela Coleta de Amostras em Medidas Microbiómicas Relativas e Absolutas , fornece uma avaliação abrangente dos preconceitos introduzidos durante a coleta de amostras, comparando métodos de quantificação relativa e absoluta. Neste estudo, os autores avaliaram como duas soluções de preservação comumente utilizadas e o armazenamento a curto prazo a diferentes temperaturas influenciam tanto as abundâncias microbianas relativas quanto absolutas.

Os autores defend fortemente a incorporação da quantificação absoluta na investigação do microbioma. Eles enfatizam que a falta de um método de quantificação absoluta universalmente aceite nos estudos do microbioma é uma falha notável. A quantificação absoluta é crítica, pois previne correlações erróneas entre microrganismos e a biologia do hospedeiro que podem surgir quando apenas os dados de abundância relativa são considerados. Além disso, altera significativamente as conclusões sobre as interações entre os componentes do microbioma e a sua influência no hospedeiro humano. Assim, a adoção de medições de abundância absoluta é essencial para interpretações mais precisas dos dados do microbioma.

Fluxo de Quantificação de Abundância Absoluta

Figura 6. Fluxo de trabalho da quantificação da abundância absoluta no Microbioma

Integração de Dados de Abundância Relativa e Absoluta no Microbioma

Estimativa da herdabilidade de táxons microbianos continua a ser um desafio complexo na investigação do microbioma. Tradicionalmente, dados de abundância relativa têm sido utilizados para inferir a herdabilidade; no entanto, as limitações intrínsecas às medições de abundância relativa podem resultar em estimativas imprecisas ou enganosas. Estas limitações decorrem do fato de que a abundância relativa não reflete necessariamente as verdadeiras contribuições genéticas das comunidades microbianas, uma vez que é influenciada por fatores como a profundidade de sequenciação e a variabilidade das amostras.

Os dados de abundância relativa podem distorcer a herdabilidade do microbioma. apresenta uma abordagem inovadora para estimar a herdabilidade dos microbiomas, integrando dados de abundância relativa e absoluta. O método proposto envolve a análise simultânea da abundância relativa juntamente com a abundância absoluta para fornecer uma estimativa mais precisa da herdabilidade. Inicialmente, os dados de abundância relativa são utilizados para estimar a herdabilidade dos táxons microbianos. A seguir, a inclusão de dados de abundância absoluta permite uma avaliação mais precisa, mitigando os preconceitos inerentes à abundância relativa isoladamente. Esta abordagem integrada oferece uma representação mais fiável da herdabilidade do microbioma, proporcionando insights que estão mais próximos da verdadeira influência genética das comunidades microbianas.

Figura 7. O uso de abundâncias relativas leva a estimativas de herdabilidade enviesadas quando existem correlações genéticas e/ou ambientais entre micróbios e hospedeiros.

Vantagens da CD Genomics Sequenciação de Quantificação Absoluta de Amplicons Tecnologia

Aquisição de Dados Abrangente: A tecnologia permite a geração simultânea de três conjuntos de dados distintos a partir de um único teste, proporcionando assim um resultado mais rico e detalhado.

Requisitos de Amostra Minimizada: O método requer um volume de amostra inferior, reduzindo o risco de perda de dados devido à disponibilidade insuficiente de amostras ou à ausência de cópias de segurança.

Alto Rendimento e Sensibilidade: A tecnologia oferece alto rendimento, com a capacidade de alcançar quantificação absoluta para uma ampla gama de espécies microbianas dentro da faixa de deteção, garantindo uma análise abrangente.

Quantificação Relativa e Absoluta Complementar: A combinação de quantificação relativa e absoluta proporciona uma validação robusta dos resultados, reduzindo a ocorrência de falsos positivos frequentemente associados a métodos tradicionais de quantificação relativa.

Eliminação de Erros Sistemáticos em qPCR de Múltiplas Plataformas: A abordagem mitiga os vieses sistemáticos frequentemente encontrados na quantificação de qPCR em múltiplas plataformas, garantindo resultados mais fiáveis.

Especificidade e Sensibilidade Superiores: O método de padrão interno oferece maior especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade na quantificação em comparação com as técnicas convencionais de qPCR.

Inibição de PCR Minimizada: O método reduz o impacto de inibidores residuais de PCR provenientes de processos de extração de DNA, garantindo a precisão e fiabilidade dos resultados.

Design e Otimização Simplificada de Primers: A abordagem evita os desafios tipicamente encontrados no design e otimização de primers que são inerentes ao qPCR e a outros ensaios quantitativos.

Resumo

A abundância absoluta e a abundância relativa são dois conceitos essenciais na investigação do microbioma. A abundância absoluta fornece a contagem real de microrganismos numa amostra, enquanto a abundância relativa descreve a representação proporcional de cada microrganismo dentro da amostra.

No contexto do rRNA 16S e do sequenciamento metagenómico, ambos os tipos de abundância têm aplicações específicas:

• Sequenciação de rRNA 16SA abundância relativa é utilizada principalmente para a análise da estrutura da comunidade. Se a abundância absoluta for necessária, deve ser determinada através de técnicas suplementares, como qPCR, para quantificar a carga microbiana total.
• Sequenciação MetagenómicaEnquanto a abundância relativa é utilizada para obter uma compreensão abrangente das comunidades microbianas e das suas funções, a abundância absoluta requer métodos quantitativos para estimar a abundância total de microrganismos.

Este artigo tem como objetivo esclarecer os conceitos relacionados à abundância nestas tecnologias de sequenciação e fornecer orientações sobre como aplicar eficazmente tanto a abundância absoluta como a relativa em estudos de microbioma.

Referências:

1. Maghini, D.G., Dvorak, M., Dahlen, A. et al. Quantificação do viés introduzido pela coleta de amostras em medições microbiómicas relativas e absolutas. Nat Biotechnol 42, 328–338 (2024). Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça o texto que deseja traduzir.
2. Bruijning, M., Ayroles, J.F., Henry, L.P. et al. Dados de abundância relativa podem distorcer a herdabilidade do microbioma. Microbiome 11, 222 (2023). Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. No entanto, posso ajudar com traduções de texto que você fornecer. Por favor, envie o texto que deseja traduzir.