Visão Geral da Análise de Dados RRBS: Pipeline, Ferramentas de Alinhamento, Bases de Dados e Desafios

O rápido desenvolvimento das tecnologias de sequenciação de alto rendimento agora proporciona oportunidades para investigar a metilação do DNA com resolução de base única e alta cobertura em grande escala. A sequenciação com bisulfito é o padrão-ouro para medir a metilação nos genomas de interesse (Wreczycka et al., 2017). O sequenciação de bisulfito com representação reduzida (RRBS) tem sido amplamente utilizado para estudar a metilação de DNA em todo o genoma devido ao seu custo de sequenciação significativamente reduzido e à alta cobertura e sensibilidade de sequenciação (Gu et al., 2010; Meissner et al., 2005).

Introdução ao RRBS

RRBS é um método padronizado amplamente utilizado para a análise de metilação do DNA, que delineia precisamente os padrões de metilação nos genomas ao aproveitar a tecnologia de sequenciamento em combinação com a análise bioinformática. Este método oferece a vantagem de uma análise de alta resolução a nível de base única, facilitando assim uma avaliação precisa do estado de metilação de cada base de citosina, com uma notável eficiência de custos. A aplicação de RRBS abrange um amplo espectro na biologia e na investigação médica. Tem sido amplamente apropriado para o estudo de vários temas, como fatores de risco de doenças, características genéticas, descoberta de biomarcadores, tumorigenese, distúrbios mentais, doenças metabólicas, distúrbios autoimunes, bem como melhorias em programas de reprodução de plantas e animais e investigação reprodutiva.

Aplicação de RRBS

RRBS serve como um método potente para explorar padrões de metilação em todo o genoma e ajuda os investigadores a mapear paisagens de metilação em várias regiões genómicas, incluindo promotores, áreas intergénicas, intrões e locais de terminação da transcrição. Tais investigações desvendam o papel funcional da metilação do DNA na orquestração da regulação genética e no contexto mais amplo da herança epigenética. Ao comparar os níveis de metilação em amostras diversas, pode-se identificar locais de metilação diferencialmente modificados - posições genómicas que demonstram variações notáveis nos seus estados de metilação sob diferentes estados fisiológicos, condições de doença ou circunstâncias ambientais. Estas descobertas desempenham um papel significativo na decifração da patogénese da doença, na identificação de potenciais biomarcadores e na compreensão do impacto dos fatores ambientais na metilação do genoma.

RRBS é frequentemente utilizado na investigação do câncer. Ao contrastar as diferenças de metilação entre amostras cancerígenas e os seus homólogos normais, o RRBS pode facilitar a descoberta de marcadores de metilação pertinentes ao início e à progressão do câncer. Esta abordagem é crucial para a deteção precoce do câncer, identificação de alvos terapêuticos e elucidação dos mecanismos de desenvolvimento tumoral. Além disso, os dados do RRBS podem também contribuir significativamente para a investigação epigenética, incluindo a análise de padrões de metilação específicos de tecidos, exame das variações genéticas de metilação interindividuais e investigações sobre o impacto de fatores ambientais na metilação genómica.

O RRBS tem sido amplamente utilizado na agricultura para estudar o desenvolvimento das culturas, a adaptabilidade e as características agronómicas. Ao comparar padrões de metilação entre várias variedades de culturas, podem ser revelados marcadores de metilação específicos associados a características agronómicas essenciais, como rendimento, qualidade e resiliência. Estas informações ajudam na seleção de variedades superiores e no aprimoramento genético direcionado, proporcionando uma forma de aumentar tanto o rendimento quanto a tolerância ambiental. RRBS apoia a investigação sobre as mudanças dinâmicas na metilação do DNA ao longo do crescimento e desenvolvimento das culturas. Uma análise dos padrões de metilação em diferentes estágios de crescimento ou dentro de órgãos distintos pode decifrar o papel da metilação genómica na orquestração dos processos de crescimento, revelando locais de metilação e redes relacionadas com a regulação do crescimento.

Além disso, RRBS os dados podem ser emparelhados com Sequenciação de RNA dados para realizar análises correlacionais entre metilação e expressão génica. Ao ligar os locais de metilação com os níveis de expressão génica, o papel regulador da metilação na expressão génica pode ser revelado, e redes regulatórias pertinentes a processos biológicos específicos ou doenças podem ser identificadas.

Pipeline de Análise de Dados RRBS

A análise dos padrões de metilação do DNA em escala genómica é essencial para compreender os mecanismos subjacentes da metilação do DNA. O pipeline computacional para a análise de RRBS os dados estão mostrados na Figura 1.

Figura 1. Pipeline para análise de dados RRBS. CpG: sequências CG, C é citosina e G é guanina. CHG e CHH: H é A (adenina), C ou T (timina).

A análise de RRBS os dados normalmente abrangem os seguintes passos:

Controlo de Qualidade: O controlo de qualidade é o primeiro passo na análise de dados, garantindo alta qualidade e fiabilidade dos dados. Este passo normalmente utiliza ferramentas como o FastQC para avaliar a qualidade dos dados de sequenciação bruta. Estas ferramentas analisam métricas como a distribuição da qualidade das bases, o conteúdo de GC, a distribuição do comprimento das sequências e a sobre-representação para identificar contaminação, sequências de baixa qualidade ou outros problemas, permitindo que sejam tomadas medidas adequadas de filtragem e aparo.

Alinhamento ao Genoma de Referência: Uma vez passado pelo controlo de qualidade, os dados de sequenciação filtrados são alinhados a um genoma de referência. RRBS análise de dados, devido ao método que visa fragmentos de DNA específicos, o processo de alinhamento deve considerar a especificidade dos locais de clivagem das enzimas. Ferramentas de alinhamento comuns incluem Bismark, BSseeker2, etc. Os resultados do alinhamento são tipicamente salvos em formato SAM ou BAM para identificação e análise subsequente de locais metilados.

Identificação de Locais Metilados: Após o alinhamento dos dados, surge a necessidade imperativa de identificar os locais metilados. Este passo crucial normalmente desenrola-se em duas fases: identificação baseada em alinhamento e identificação baseada em proporção. A primeira depende da distinção de locais metilados ao contrastar sequências metiladas com o genoma de referência. Por outro lado, a abordagem baseada em proporção envolve a estimativa dos níveis de metilação em cada local através de análise estatística.

Estimativa dos Níveis de Metilação: Uma vez identificados os locais metilados, a tarefa subsequente consiste em quantificar os seus níveis de metilação. Normalmente, isso envolve estimar os níveis de metilação calculando a razão entre fragmentos metilados e fragmentos não metilados dentro dos dados de sequenciação. Estas razões são comumente denominadas como valores Beta (valores β) ou Razões de Metilação. Através de tal estimativa, podem-se obter informações sobre o grau de metilação em vários loci genómicos, melhorando assim a nossa compreensão das modificações epigenéticas.

Figura 2. Gráfico MD mostrando a alteração logarítmica da metilação e a abundância média de cada sítio CpG. (Chen et al., 2017)

Análise de Metilação Diferencial: Após a estimativa do nível de metilação, a análise de metilação diferencial compara os níveis de metilação entre diferentes amostras para identificar locais de metilação diferencialmente alterados. Esta análise utiliza comumente métodos estatísticos (por exemplo, limma, edgeR, DMRcate) para testar diferenças significativas nos níveis de metilação e determinar locais de metilação diferencialmente alterados com base em limiares pré-determinados.

Anotação Funcional: A anotação funcional de locais diferencialmente metilados ajuda a compreender a sua distribuição genómica e funções biológicas. Este passo envolve tipicamente a utilização de informações de anotação genómica, como estruturas de genes, regiões promotoras, potenciadores, etc. Associar locais diferencialmente metilados a funções biológicas explora ainda mais a importância biológica da metilação.

Análise de Caminhos: Após a análise diferencial de metilação, é frequentemente realizada uma análise de vias em genes diferencialmente metilados para compreender as suas vias funcionais e redes de interação em processos biológicos. A análise de vias utiliza tipicamente bases de dados e ferramentas de bioinformática (por exemplo, DAVID, Enrichr, GSEA) para identificar vias biológicas e módulos funcionais associados a genes diferencialmente metilados.

Ferramentas de Análise de Dados RRBS

Devido à complexidade dos alinhamentos de sequenciação por bisulfito (as sequências alinhadas não correspondem exatamente ao genoma de referência, e a complexidade das bibliotecas é reduzida), não é possível utilizar o software padrão de alinhamento de sequências. Devido às propriedades únicas de RRBS, são necessárias ferramentas especiais para alinhamento e análise. Cinco algoritmos de mapeamento comumente utilizados para análise de benchmarking em dados de RRBS incluem Bismark, BS-Seeker2, BSMAP, GSNAP e bwa-meth, que estão listados na Tabela 1 (Sun et al., 2018).

Tabela 1. Breve descrição de diferentes ferramentas de alinhamento para a análise de dados RRBS.

Bismark é uma ferramenta amplamente utilizada na análise de dados RRBS devido à sua eficiência, precisão e alta fiabilidade. Ela lida habilmente com as peculiaridades inerentes em RRBS dados, como a presença de locais de corte de enzimas de restrição e a heterogeneidade da metilação do DNA. No entanto, a sua desvantagem é uma velocidade de processamento mais lenta para dados em grande escala, particularmente com genomas maiores. O Bismark pode ser utilizado para alinhar Sequenciação RRBS dados a um genoma de referência, bem como identificar e analisar locais de metilação.

Em contraste, o BSseeker2 constitui outra ferramenta popular para a análise de dados RRBS, conhecida pelo seu forte desempenho ao lidar com dados em grande escala e pela sua velocidade de alinhamento mais rápida. A instalação e configuração do BSseeker2 podem exigir algum trabalho extra em comparação com outras ferramentas. Não obstante, demonstra competência em corresponder dados de sequenciação RRBS, reconhecer locais de metilação e realizar análises de metilação diferencial.

O BSMAP, embora simples e fácil de utilizar com um processo de instalação e configuração direto, destaca-se principalmente em pequenas escalas. RRBS dados devido à sua alta precisão. No entanto, pode não ser tão eficaz quanto outros algoritmos em resposta a padrões de metilação complexos.

O GSNAP é versátil, servindo não apenas para alinhar dados de sequenciação de DNA, mas também dados de sequenciação de RNA, entre outras aplicações. Demonstra um desempenho robusto na manipulação de conjuntos de dados genómicos complexos, exibindo uma alta precisão de alinhamento. No entanto, a sua desvantagem reside na potencial lentidão no processamento de dados RRBS em grande escala e na configuração e utilização relativamente complexas.

bwa-meth, adaptado especificamente para dados de metilação, é particularmente adequado para processar dados de sequenciação RRBS e de metiloma semelhantes. Desempenha-se admiravelmente ao lidar com escalas pequenas. RRBS dados, exibindo altas velocidades de alinhamento. No entanto, gerir certos casos especializados pode apresentar complexidade.

MethylDackel, uma ferramenta leve, especializa-se na alinhamento e identificação de locais metilados em dados de sequenciação RRBS e outros dados de metiloma. Destaca-se pela sua eficiência e simplicidade, tornando-a adequada para processar rapidamente conjuntos de dados RRBS de pequena escala. No entanto, a sua funcionalidade pode ser comparativamente básica, faltando as capacidades de análise extensivas de outras ferramentas. MethylDackel é útil para processar rapidamente conjuntos de dados de tamanho modesto. RRBS dados e a realização de identificação preliminar de locais de metilação.

O Trim Galore funciona normalmente como uma ferramenta de pré-processamento, dedicada ao controlo de qualidade e filtragem. RRBS dados. Ele detecta automaticamente e corta sequências de baixa qualidade dentro dos dados de sequenciação, melhorando a qualidade dos dados. No entanto, o Trim Galore em si não realiza alinhamento ou identificação de locais de metilação e necessita de integração com outras ferramentas para uma análise abrangente.

Bases de Dados de Metilação de DNA

Dedicadas ao armazenamento e gestão de dados de metilação do DNA, as bases de dados de metilação do DNA são recursos inestimáveis que compilam um corpo substancial de dados de metilação, abrangendo diferentes espécies, tipos celulares, tipos de tecidos e estados fisiológicos. Estas bases de dados oferecem tipicamente diversos tipos de dados que incluem dados de metilação do genoma completo, informações sobre locos de metilação anotados, paisagens de metilação e funcionalidades e regulações das modificações de metilação. Dada a grande quantidade de dados de metilação que estas bases de dados contêm, os investigadores podem explorar a distribuição, regulação e funções da metilação do DNA ao longo do genoma, pesquisando e analisando os dados disponíveis. Além disso, podem ajudar os investigadores a compreender os papéis e mecanismos da metilação do DNA em processos biológicos, incluindo a expressão génica, diferenciação celular, desenvolvimento e progressão da doença. A investigação baseada em dados de metilação do DNA necessita do desenvolvimento e implementação de várias ferramentas e algoritmos bioinformáticos, e estas bases de dados fornecem uma base de dados vital e uma plataforma de verificação para o desenvolvimento de ferramentas.

As bases de dados comuns de metilação do DNA incluem:

Navegador do Genoma UCSC: Servindo como um navegador genómico online, o UCSC Genome Browser fornece dados de metilação abrangentes que cobrem diversas espécies. Os utilizadores podem aceder a vários conjuntos de dados de metilação, abrangendo diferentes tecidos, tipos de células e estados de doença.

CÓDIGO: O projeto ENCODE (Enciclopédia de Elementos de DNA) é um esforço de pesquisa abrangente destinado a identificar e anotar elementos funcionais dentro do genoma humano. Esta iniciativa agrega grandes quantidades de dados genómicos funcionais, incluindo dados de metilação do DNA, oferecendo aos investigadores recursos abrangentes de anotação funcional genómica.

Projeto de Epigenómica: Roteiro O Projeto Roadmap Epigenomics é uma colaboração internacional em grande escala destinada a construir mapas epigenómicos para humanos e organismos modelo. Ele reúne diversos dados epigenómicos, incluindo dados de metilação do DNA, proporcionando aos investigadores abundantes recursos epigenómicos.

TCGA: O Atlas do Genoma do Cancro (TCGA) é um projeto internacional de grande escala que reúne dados genómicos de várias amostras de cancro. Abrange quantidades significativas de dados de metilação de amostras de cancro, constituindo um recurso vital para a investigação do cancro.

DDBJ/EMBL/GenBank: DDBJ (Banco de Dados de DNA do Japão), EMBL (Laboratório Europeu de Biologia Molecular) e GenBank representam três grandes bases de dados de sequências genómicas que organizam sequências genómicas em escala global e informações biológicas relacionadas, incluindo dados de metilação de DNA.

GEO: O GEO (Gene Expression Omnibus) serve como um repositório público para dados genómicos, acumulando extensos conjuntos de dados de expressão génica e epigenómica, incluindo dados de metilação do DNA.

Uma grande quantidade de dados foi gerada pelas tecnologias de deteção de metilação de DNA baseadas em NGS nos últimos anos. Vários bancos de dados de metilação foram desenvolvidos para armazenar esses dados e estão disponíveis para os investigadores (Tabela 2) (Su et al., 2012). Com o desenvolvimento de um estudo sobre metilação de DNA, mais bancos de dados serão estabelecidos e, assim, mais informações sobre metilação serão conhecidas.

Tabela 2. Bases de dados de Metilação de DNA.

Desafios da chamada de metilação na Análise de Dados RRBS

Existem dois fatores-chave que afetam a precisão das chamadas de metilação ao determinar o estado de metilação das leituras de sequenciamento de bisulfito. Primeiro, as leituras de sequenciamento devem ser corretas e derivar inteiramente de sequências convertidas por bisulfito. Em segundo lugar, as leituras devem ser corretamente mapeadas ao genoma de referência. A falha destes dois fatores resultará na geração de chamadas de metilação incorretas. E, em casos extremos, o ruído dessas chamadas erradas pode afetar negativamente as conclusões do experimento (Krueger et al., 2012). O processo de digestão com enzimas de restrição (comumente utilizando a endonuclease de restrição MspI), conversão por bisulfito e sequenciamento envolve RRBS afetaria estes dois fatores.

• Digestão de MspI

A digestão com MspI resultaria numa ampla gama de fragmentos de DNA de diferentes tamanhos (Figura 3), e geralmente fragmentos entre 40 e 220bp serão selecionados por tamanho para a biblioteca RRBS. Bastantes fragmentos digeridos com MspI, mesmo mais curtos que 40bp, serão gerados durante o processo. Se o processo de seleção por tamanho não for tão bom quanto na teoria, muitas vezes um número considerável de fragmentos abaixo de 40bp pode acabar no RRBS biblioteca.

Figura 3. As frequências relativas dos tamanhos dos produtos de digestão com MspI no genoma de referência humano. (Suzuki et al., 2010)

Os fragmentos mais curtos têm maior probabilidade de serem sequenciados do que os fragmentos maiores (≥300bp). No entanto, leituras curtas nos dados de sequenciação com bisulfito podem resultar em baixa eficiência de mapeamento na análise de dados (Figura 4).

Figura 4. Desempenho do mapeamento consciente de metilação (tendencioso) e do mapeamento não tendencioso para dados de sequenciação de metilação. (Krueger et al., 2012)

• Conversão de bisulfito

O tratamento com bisulfito do DNA medeia a desaminação da citosina não metilada em uracilo, e estes resíduos convertidos serão lidos como timina, o que é determinado pela amplificação por PCR e pela subsequente análise de sequenciação (Figura 5).

Figura 5. O princípio da sequenciação com bisulfito.

A sequenciação por bisulfito baseia-se na conversão de cada resíduo de citosina não metilada em uracilo. A conversão incompleta causará resultados falso-positivos devido à interpretação incorreta das citosinas não metiladas não convertidas como citosinas metiladas (Figura 6).

Figura 6. Conversão incompleta de bisulfito.

• Sequenciação

Devido ao tamanho curto do fragmento selecionado no biblioteca RRBS, vários fatores no processo de sequenciação afetariam o RRBS análise de dados (Krueger et al., 2012):

Qualidade das chamadas de bases: A qualidade das chamadas de bases tende a diminuir à medida que o comprimento das leituras aumenta. As fracas qualidades de base podem levar a chamadas de metilação incorretas e/ou mapeamentos errados.

Erros de chamada de base: Os erros de sequenciação nas leituras podem resultar em baixa eficiência de mapeamento (leituras que não são alinhadas de todo), chamadas de metilação incorretas ou desalinhamentos, que também provavelmente levarão a chamadas de metilação incorretas.

Contaminação por adaptador: Em muitas bibliotecas, uma proporção das leituras passa pelo inserto e começa a sequenciar o adaptador na extremidade 3'. Essa "contaminação por adaptador" pode levar a baixas eficiências de mapeamento se a leitura não conseguir alinhar, ou, se mapeada, pode resultar em alinhamentos falsos que podem levar a chamadas de metilação incorretas.

Reparo final: As posições preenchidas durante o reparo final irão inferir o estado de metilação da citosina utilizada na reação de preenchimento, mas não da verdadeira citosina genómica.

Sequenciação em pares: Par em pares Sequenciação RRBS (especialmente com comprimentos de leitura longos) produzem informações de metilação redundantes se os pares de leitura se sobrepuserem.

Na CD Genomics, estamos dedicados a fornecer soluções fiáveis. sequenciação epigenómica serviços, incluindo sequenciação de bisulfito direcionada, sequenciação de bisulfito com representação reduzida (RRBS), sequenciação de bisulfito de genoma completo, Sequenciação MeDIPe ChIP-seq.

Referências:

1. Gu, H., et al., Mapeamento de metilação de DNA em escala genómica de amostras clínicas com resolução de um único nucleótido. Métodos da Natureza, 2010, (7):133-136.
2. Krueger, F., et al., Análise do metiloma de DNA utilizando dados de sequenciação curta com bisulfito. Métodos da Natureza 2012,9,145-151.
3. Meissner, A., et al., Sequenciação de bisulfito de representação reduzida para análise comparativa de metilação de DNA em alta resolução. Pesquisa em ácidos nucleicos, 2005, (33):5868-5877.
4. Su J., et al., Avanços em Ferramentas de Bioinformática para Dados de Sequenciação de Alto Débito de Metilação de DNA. Genética Hereditária, 2012(1):107.
5. Sun, X., et al. Uma avaliação abrangente de software de alinhamento para dados de sequenciação bisulfito de representação reduzida. Bioinformática, 2018(34):2715-2723.
6. Suzuki, M., et al. Design otimizado e análise de dados de ensaios de metilação de citosina baseados em etiquetas. Biologia do genoma, 2010(11): R36.
7. Wreczycka, K., et al., Estratégias para analisar dados de sequenciação com bisulfito. Revista de Biotecnologia, 2017(261):105-115.
8. Chen Y, Pal B, Visvader J E, et al. Análise de metilação diferencial de experiências de sequenciação bisulfito de representação reduzida usando edgeR. F1000Research, 2017, 6.