Genoma Mitocondrial e Sequenciação de DNA Mitocondrial (mtDNA)

Visão Geral do Genoma Mitocondrial

O mitocôndrio é um orgânulo indispensável para quase todas as células eucarióticas. No entanto, existem algumas exceções, como as células vermelhas do sangue maduras. O genoma mitocondrial é uma molécula circular de dupla cadeia com aproximadamente 16.569 pb e codifica 37 genes, incluindo 22 tRNAs, 2 rRNAs e 13 proteínas que são subunidades de complexos enzimáticos do sistema de fosforilação oxidativa. Portanto, o genoma mitocondrial é muito importante para a energetica celular e a sobrevivência. Além disso, devido à herança materna, o mtDNA pode ser utilizado para traçar a origem e a ancestralidade dos eucarióticos.

Figura 1. A estrutura do genoma mitocondrial humano (da Wiki).

• Genoma Mitocondrial e Doença Humana

As mutações no DNA mitocondrial (mtDNA) estão associadas a uma ampla variedade de doenças humanas, como doenças autoimunes, câncer e distúrbios neurodegenerativos como Parkinson e Alzheimer. Mas por que um genoma tão pequeno pode afetar tanto a saúde humana? Os pesquisadores descobriram que o mtDNA é altamente suscetível a ataques mutagénicos de espécies reativas de oxigénio, levando ao acúmulo de mutações somáticas. Juntamente com a capacidade limitada de reparação de danos no DNA na organela, as alterações no mtDNA ocorrem a uma taxa muito mais alta do que aquelas no DNA nuclear. Além disso, as células eucarióticas podem conter até milhares de mitocôndrias. A heteroplasmia do mtDNA é um indicador de disfunção metabólica celular. Portanto, tem havido uma atenção crescente para a análise do genoma mitocondrial.

Sequenciação de DNA Mitocondrial

Sequenciação de DNA mitocondrial é uma abordagem poderosa para a deteção de mutações no ADNmt associadas a doenças humanas, determinação da heteroplasmia do ADNmt, deteção de modificações epigenéticas e classificação de haplogrupos. O sequenciamento de Sanger torna o sequenciamento do ADN mitocondrial fácil e acessível. A introdução das tecnologias de sequenciamento de nova geração (NGS) é a maior mudança de paradigma na genómica mitocondrial. O NGS pode gerar ordens de magnitude mais dados de uma forma mais barata e rápida.

• Fluxo de Trabalho de Sequenciação Mitocondrial Usando NGS

O fluxo de trabalho do sequenciamento de DNA mitocondrial inclui estas etapas: isolamento de DNA genómico (contendo tanto DNA nuclear como mitocondrial), enriquecimento de mtDNA, geração de bibliotecas, sequenciamento em alta capacidade e análise bioinformática. O mtDNA das amostras de DNA é amplificado individualmente utilizando o método de PCR de longo alcance, com dois fragmentos sobrepostos (>8 Kb). Existem kits comerciais de PCR de longo alcance disponíveis no mercado, como o Qiagen LongRange PCR Kit e o SequalPrep™ Long PCR Kit com dNTPs. A PCR de longo alcance é um método flexível, eficiente e rentável para sequenciar regiões genómicas específicas, especialmente quando combinado com plataformas de NGS. Este método utiliza polimerases de DNA de longo alcance que são capazes de amplificar sequências de até 15 Kb ou mais. Permite a amplificação de cromossomas mitocondriais inteiros. Após esta PCR, a eletroforese em gel de agarose (0,7%) é utilizada para confirmar a presença do produto da PCR, e o produto da PCR é então quantificado. As bibliotecas são então construídas para fragmentação de DNA, ligação de adaptadores com código de barras e amplificação, seguidas pela determinação da concentração com qPCR e sequenciamento com Ion Torrent™ PGM™, Illumina HiSeq/MiSeq, outras plataformas de NGS ou plataformas de sequenciamento de leitura longa, como PacBio RSII e Oxford nanopore MinION™.

• Análise Bioinformática

Após a sequenciação, a profundidade de cobertura e outros parâmetros são estimados e a qualidade das leituras é avaliada para filtragem e aparo. O alinhamento das sequências mitocondriais pode ser realizado utilizando o ClustalW, e os quadros de leitura abertos (ORFs) e fragmentos de genes rRNA podem ser identificados e anotados. As mutações de sequência, como SNPs, são detectadas e a sua frequência alélica é estimada. A associação entre mutações e doenças humanas pode ser prevista. E a filogenia animal pode ser inferida utilizando Máxima Verossimilhança ou Análise Bayesiana.

Referências:

1. Smith D R. O passado, presente e futuro da genómica mitocondrial: já sequenciámos mtDNAs suficientes? Briefings em genómica funcional, 2015, 15(1): 47-54.
2. Taanman J W. O genoma mitocondrial: estrutura, transcrição, tradução e replicação. Bioquímica e Biofísica Acta (BBA)-Bioenergética, 1999, 1410(2): 103-123.
3. Douglas A P, Vance D R, Kenny E M, et al.Sequenciação de próxima geração do genoma mitocondrial e associação com a nefrite por IgA numa população de transplante renal. Relatórios científicos, 2014, 4: 7379.