Como Escolher o Método de Genotipagem SNP Adequado

Os SNPs são uma parte integral dos estudos genéticos, e Genotipagem de SNPs é um método comum de deteção de SNPs. Existem muitos métodos de tipagem de SNP bem estabelecidos, cada um com as suas próprias características e aplicabilidade.

Os métodos de digitação comuns incluem: Sequenciação de Sangertipagem de reação de deteção de ligase (LDR), multiplex Genotipagem SNP SNaPshot, Genotipagem de SNP Taqman, Genotipagem de SNPs MassArray e tipagem PCR-RFLP, etc., fornecendo diversas soluções de tipagem de SNP para investigadores.

Então, como escolher a plataforma de ensaio certa para o seu experimento? O artigo descreve as características técnicas de cada método de tipagem e compara-os para ajudar os investigadores.

Sequenciação de Sanger

A sequenciação Sanger baseia-se em reações de terminação com didioxinucleotídeos para gerar fragmentos de diferentes comprimentos para sequenciação, sendo o "padrão ouro" para a deteção de SNPs. A taxa de deteção de SNPs pela sequenciação Sanger é próxima de 100%.

A vantagem da sequenciação de Sanger é que os resultados são precisos, não apenas para determinar o tipo e a localização de mutações, mas também para descobrir locos SNP desconhecidos.

No entanto, a sua desvantagem é a baixa taxa de transferência e o alto custo. Portanto, a sequenciação de Sanger é adequada para escalas de tipagem com poucos loci e poucas amostras. Esta técnica de tipagem é muito adequada para projetos com requisitos de precisão extremamente elevados ou com um tamanho de amostra extremamente pequeno (várias ou dezenas).

PCR-RFLP

PCR-RFLP é o método de pesquisa mais clássico para tipagem de SNP. A sua maior vantagem é que não requer instrumentos especiais, a operação do teste é simples e barata, e também é adequada para a deteção de amostras de volume médio; a desvantagem é que muitos locos de SNP não podem ser detetados por este método, e algumas enzimas de restrição são caras e não estão facilmente disponíveis. É propenso a resultados falso-positivos e requer muita mão-de-obra, leva um tempo relativamente longo e não é adequado para deteção de amostras grandes em alto rendimento. Esta é uma tecnologia de tipagem de SNP precoce, e é difícil atender às necessidades de tipagem em lote em termos de rendimento e eficiência, por isso esta tecnologia ainda é utilizada apenas em laboratórios individuais.

Uma desvantagem principal dos arrays de SNP é que sofrem de viés de ascensão, ou seja, não conseguem identificar associações marcador-característica no caso de SNPs que não estavam presentes na população utilizada para o desenvolvimento do array. Além disso, uma desvantagem típica na utilização de arrays de SNP é a possibilidade de que a informação (por exemplo, a localização cromossómica do SNP) utilizada para o design do array esteja desatualizada e que não haja consistência na utilização de SNPs entre diferentes formatos de arrays de genotipagem.

Genotipagem de SNP por PCR-RFLP e sequenciação de Sanger^[1]

Sequenciação de Próxima Geração (NGS)

Com a popularidade da tecnologia NGS, a capacidade de sequenciamento aumentou significativamente e o custo de sequenciamento foi reduzido em comparação com o sequenciamento Sanger. O NGS pode ser utilizado para tipagem de SNP, não só a extensão da leitura de sequenciamento atende aos requisitos de tipagem, mas também pode capturar centenas de locos SNP ao mesmo tempo, e os primers de código de barras podem distinguir diferentes amostras, permitindo experimentos de tipagem de alto rendimento com múltiplos locos e grandes amostras em um único sequenciamento.

Comparado com o sequenciamento Sanger, este método não só retém as vantagens do sequenciamento, mas também compensa a limitação da sua capacidade de produção insuficiente, reduzindo significativamente a necessidade de volume de amostra. A tipagem NGS também está a ser rapidamente promovida na área.

Sequência RAD: descoberta e genotipagem de SNPs por sequenciação de nova geração para mapeamento genómico^[2]

Reação de Detecção de Ligase (LDR)

A LDR utiliza ligase de alta temperatura para realizar o reconhecimento do locus de polimorfismo genético. Assim que a ligase de alta temperatura detecta que existe uma incompatibilidade de bases de mutação pontual no gene na junção do DNA e de dois oligonucleotídeos complementares, a reação de ligação não pode prosseguir.

Neste método, duas sondas com comprimentos diferentes são projetadas simultaneamente para o locus SNP. Quando as extremidades da sonda não estão emparelhadas com uma base do molde, a reação de ligação não pode ser realizada e não há produto de ligação; pelo contrário, se a sonda for completamente complementar ao DNA molde, a reação de ligação é, portanto, realizada, e esta reação de ligação específica pode ser repetida para alcançar a amplificação linear. Finalmente, a deteção do locus SNP é realizada através da varredura do comprimento do fragmento por fluorescência.

A vantagem do método de deteção de ligase LDR é que é aplicável a qualquer locus polimórfico, o resultado da tipagem é preciso, podem ser realizadas múltiplas reações, a relação custo-benefício é alta e o experimento é flexível. No entanto, em comparação com o TaqMan E métodos de sequenciação Sanger, o método LDR pode realizar a deteção simultânea de múltiplos locos e melhorar o rendimento da deteção, pelo que leva um certo tempo a construir um esquema de tipagem múltipla na fase inicial. Este método é muito adequado para o mesmo esquema de tipagem e para os requisitos de tipagem de amostras contínuas, o que pode aumentar o rendimento experimental e reduzir o preço unitário da tipagem.

SNaPshot

Esta tecnologia, desenvolvida pela Applied Biotechnology (ABI), é uma tecnologia de tipagem baseada no princípio da extensão de uma única base marcada fluorescentemente, e destina-se principalmente a projetos de tipagem de SNP de média capacidade. O sistema de reação contém enzimas de sequenciação, quatro ddNTPs marcados fluorescentemente, primers e templates de produto de PCR, sendo que os primers são terminados após uma extensão de base. Após a deteção pelo sequenciador da ABI, o locus de SNP correspondente ao produto de extensão é determinado de acordo com o pico deslocado, e o tipo de base incorporada pode ser conhecido pela cor do pico, determinando assim o genótipo da amostra. Os templates de produto de PCR podem ser obtidos através de múltiplos sistemas de reação de PCR.

Recursos do SNaPshot

(1) Digitação precisa: obter diretamente os resultados da deteção da composição base do locus, que são intuitivos e precisos.

(2) Detecção simultânea de múltiplos loci: A tecnologia de deteção de múltiplas bases únicas pode ser utilizada para detectar múltiplos loci SNP em cada reação, enquanto o RFLP e o TaqMan só conseguem detectar um de cada vez.

(3) Não limitado pelo tipo de polimorfismo do locus SNP: não importa se o locus é heterozigoto ou polimorfismo de inserção ou deleção, pode ser detetado num único sistema.

(4) Amostras contaminadas podem ser detectadas: Se o espectro de pico de tipagem de uma amostra desviar da distribuição normal, isso pode sugerir que a amostra pode estar contaminada ou que a concentração é demasiado baixa, enquanto outros métodos de tipagem não conseguem fazer isso. É geralmente utilizado para a análise de 10-30 locos SNP.

A sonda TaqMan MGB tem uma boa capacidade de identificar sequências ricas em A/T.

Devido ao alto preço das sondas MGB, o método da sonda Taqman é geralmente utilizado para a análise de um grande número de amostras com um pequeno número de locais SNP.

Genotipagem SNaPshot SNP^[3]

Genotipagem MassArray

A tecnologia de Espectrometria de Massa por Desorção/Ionização Assistida por Matriz de Tempo de Voo (MALDI-TOF MS) é a principal ferramenta de análise genética do mundo, lançada pela Sequenom.

Usando a característica de alta sensibilidade da espectrometria de massas, é fácil distinguir duas sequências de genes que contêm apenas uma base diferente e derivar a tipagem de SNP. A tecnologia iPLEX GOLD, baseada na plataforma MassARRAY, permite o design de reações de PCR de até 40 pesos e a deteção de genótipos, com um design experimental flexível e alta precisão nos resultados da tipagem. Ao testar centenas a milhares de amostras para dezenas a centenas de locos SNP, o MassARRAY oferece a melhor relação custo/benefício e é particularmente adequado para validar resultados encontrados em estudos de genoma amplo ou quando um número limitado de locos de estudo foi identificado.

Comparação de Métodos de Genotipagem de SNPs

Com base na excelente síntese de primers comuns e primers marcados fluorescentemente, amplificação de PCR em multiplex e tecnologias de sequenciação, a CD Genomics lançou Serviços de tipagem de SNPCobre uma plataforma completa de tipagem de SNP, desde baixo, médio a alto rendimento, que pode atender às necessidades de projetos de diferentes escalas e fornecer-lhe serviços personalizados e adaptados.

Referências:

1. Rajkumar Sankaranarayanan et al.Associação protetora do haplótipo A-T-T do gene DMT1 contra o risco de catarata nuclear relacionada com a idade humana Março de 2019 Genética Oftálmica 40(5):00-11
2. Nazarul Hasan et al.Avanços recentes na seleção assistida por marcadores moleculares e aplicações em programas de melhoramento de plantas. Agosto de 2021 Revista de Engenharia Genética e Biotecnologia 19(128)
3. Stéphanie Le Hellard et al.Genotipagem SNP em DNAs agrupados: comparação de tecnologias de genotipagem e um método semi-automatizado para armazenamento e análise de dados Setembro de 2002 Pesquisa em Ácidos Nucleicos 30(15):e74
4. Maria Svidnicki et al.Triagem de alterações genéticas relacionadas à perda auditiva não sindrómica utilizando a tecnologia MassARRAY iPLEX® Setembro de 2015 BMC Genética Médica dezasseis (um)