Sequenciação de RNA Dual: Definição e Princípio, Fluxo de Trabalho e Aplicações

O que é sequenciação de RNA dual?

Compreender como os patógenos induzem doenças requer o conhecimento sobre quais genes são expressos e como são regulados durante a infeção. O sequenciamento de RNA tem sido utilizado rotineiramente para analisar a expressão genética de patógenos microbianos. Para além do sequenciamento padrão de mRNA, novos métodos estão a surgir com base no RNA-seq, mapeando as redes pós-transcricionais controladas por pequenos RNAs e descobrindo proteínas ligadoras de RNA associadas ao próprio patógeno. O sequenciamento de RNA dual é uma das novas tecnologias de RNA-seq. Ele ilumina a transcriptómica simultânea nas interações hospedeiro-patógeno e é particularmente adequado para investigar os mecanismos moleculares das interações entre hospedeiros e patógenos. O sequenciamento de RNA dual não requer sondas específicas para espécies pré-desenhadas e permite a detecção de transcritos com baixas abundâncias de forma sensível. Além disso, possibilita a análise de transcritos específicos para o patógeno e o hospedeiro em amostras mistas de pelo menos duas espécies, revelando o papel do RNA não codificante no processo de infeção. A correlação entre a atividade genética microbiana e as reações específicas do hospedeiro também pode ser esclarecida. O sequenciamento de RNA dual pode facilitar os estudos de várias áreas, incluindo patologia e tratamento de doenças. 

O fluxo de trabalho de sequenciação de RNA dual

RNA-Seq Duplo é a análise transcriptómica paralela de patógenos bacterianos e das suas células hospedeiras eucarióticas, que geralmente envolve um fluxo de trabalho típico incluindo extração de RNA, depleção de rRNA, preparação de bibliotecas, sequenciação e análises e interpretação de dados. Entretanto, os procedimentos de análise de dados incluem pré-processamento, alinhamento e análises avançadas subsequentes, como splicing alternativo e não linear, expressão diferencial, análises epigenéticas, que finalmente resultam em um resultado que abrange relatórios de qualidade, cálculos e previsões para novos transcritos, probabilidades de transcritos diferencialmente expressos e caracterizações de transcritos.

Semelhante às metodologias transcriptómicas convencionais, o dual RNA-seq envolve quantificação, triagem de diferenças, anotação de vias, construção de redes, entre outros. Relativamente à parte anterior do processo, é necessário o genoma de referência correspondente para as análises bioinformáticas subsequentes.

Aplicações

O Dual RNA-Seq aborda a interação entre patógenos e os seus hospedeiros, onde o RNA total é extraído de células infectadas. O sequenciamento e a análise dos RNAs de interesse provenientes de patógenos bacterianos e células infectadas podem ser realizados simultaneamente, enquanto as leituras de sequenciamento misturadas são atribuídas aos seus genomas de origem. O Dual RNA-Seq baseia-se na melhoria da construção de bibliotecas e da tecnologia de sequenciamento. Pode facilitar a separação da investigação em múltiplas direções, incluindo, mas não se limitando a:

• Variações nos níveis de expressão génica do hospedeiro e do patógeno
• Estudando sRNA relacionados com infecções, RNA mitocondrial, etc.
• Estudo aprofundado de RNA não codificante relacionado à via de sinalização
• Estudo das diferenças entre patógenos selvagens e mutantes através da genómica comparativa.
• Descobrindo o mecanismo de interação entre espécies através do estudo das relações de regulação genética.
• Estudando a rede regulatória, o mecanismo patogénico durante a infeção e o mecanismo de resistência do hospedeiro no processo de interação patógeno-hospedeiro.
• Estudar as relações evolutivas entre patógenos de diferentes espécies e a descoberta adicional de seleção positiva com base em genes homólogos.

Referências:

1. Westermann A; et al. Resolução de interacções hospedeiro-patogénico através de sequenciação de RNA dual. PLOS Patógenos. 2017, 13.
2. Marsh JW; et al. Uma Metodologia Laboratorial para Sequenciação de RNA Dual de Bactérias e suas Células Hospedeiras In Vitro. Fronteiras em microbiologia. 2017, 8.