Perguntas e Respostas sobre Sequenciação ChIP

Perguntas Gerais

Como posso desenhar um experimento de ChIP-Seq?

(1) Considere a utilização de anticorpos específicos para enriquecer eficazmente fragmentos de DNA, dependendo dos objetivos do estudo.
(2) Para diferentes tipos de células, é necessário utilizar métodos específicos de extração de núcleos para obter núcleos intactos e suficientes.
A principal dificuldade com o ChIP-seq é a disponibilidade dos anticorpos utilizados para a imunoprecipitação e a capacidade de extrair quantidades suficientes de núcleos intactos.

(1) O ChIP-Seq permite uma análise verdadeira a nível do genoma. As sondas atualmente disponíveis fixadas no chip representam apenas sequências parciais do genoma completo, e a informação de hibridização obtida é tendenciosa.
(2) Para a análise de locais de ligação, o ChIP-Seq pode alcançar uma resolução de ligação de 10-30 bp ao procurar por "picos", enquanto as sondas no chip não podem ser localizadas com precisão devido ao seu comprimento, e mesmo o nível mais alto de chips comerciais atualmente disponíveis não consegue fornecer uma resolução comparável à do ChIP-Seq.
(3) O número de amostras é necessário. ChIP-chip requer até 4-5 μg de amostra, o que exige LM-PCR antes da hibridização, mas pode resultar em falsos positivos devido ao aumento do fundo, amplificação competitiva, etc. ChIP-Seq, por outro lado, requer apenas nanogramas de material inicial, que podem ser tão baixos quanto 20 ng.

Que método de construção de biblioteca ChIP-Seq você utiliza?

A sequenciação Illumina é utilizada para construir as suas bibliotecas de sequenciação ChIP-seq da seguinte forma:
(1) Enriquecimento de fragmentos de DNA por ChIP.
(2) Construção de bibliotecas de sequenciamento. Após a purificação dos fragmentos de DNA enriquecidos por ChIP, foram realizadas uma série de tratamentos, como alisamento das extremidades, adição de extremidade 3' e junção ligada, e os fragmentos na faixa de 150-300 bp foram recuperados por corte em gel eletroforético. Em seguida, os fragmentos de DNA recuperados foram amplificados por PCR e sequenciados na máquina. As sequências medidas são primeiro submetidas a alinhamento genómico e, em seguida, à enumeração de locais de ligação utilizando diferentes algoritmos.

Quais são os principais passos de um experimento de ChIP-seq?

A amplificação por PCR é necessária durante o processo de preparação da amostra e afeta o resultado final após a amplificação por PCR?

Uma vez que a quantidade de amostras de DNA provenientes de ChIP é muito pequena, é necessário um passo de amplificação por PCR durante o processo de preparação das amostras. O principal objetivo da amplificação por PCR é obter uma quantidade suficiente de DNA para a reação em linha. Se o cliente puder fornecer uma quantidade suficiente de amostras de DNA, já não realizamos a amplificação por PCR. Como se trata de uma amplificação linear, os resultados antes e depois da amplificação são muito semelhantes e, basicamente, não afetam os resultados de sequenciação.

Quais outros fatores podem afetar os resultados do ChIP-Seq?

Como selecionar anticorpos para Chip-Seq?

(1) Em termos de requisitos de qualidade de anticorpos, os anticorpos para experiências de ChIP devem ser de grau ChIP/IP ou superior.
(2) Se quiser estudar o local de ligação de um fator de transcrição específico em todo o genoma, precisa de usar um anticorpo específico gerado com esse fator de transcrição como antigénio. Se o anticorpo for difícil de obter ou não for eficaz, também pode tentar usar um anticorpo marcado, que é melhor quando o sujeito é uma planta.
(3) Anticorpos etiquetados como His, GFP, Flag, HA, etc. podem ser escolhidos. No entanto, existem alguns riscos associados ao sistema de etiqueta. Primeiro, se a fusão da proteína etiqueta afetará a capacidade do fator de transcrição de se ligar ao DNA. Em segundo lugar, se a própria proteína etiqueta tem a capacidade de se ligar ao DNA, o que pode produzir resultados falso positivos. Por último, se a proteína de fusão da etiqueta competirá com o fator de transcrição original para se ligar ao DNA e enfraquecer o enriquecimento ChIP.

Como configurar o controlo de entrada para sequenciação ChIP?

Como configurar um controlo positivo e um controlo negativo para sequenciação ChIP?

Os controlos positivos e negativos são os controlos experimentais mais básicos. Os controlos positivos geralmente escolhem anticorpos para proteínas mais conservadas que se ligam a sequências conhecidas, sendo os anticorpos de histonas ou os anticorpos da RNA Polimerase II exemplos comuns. Os controlos negativos são geralmente selecionados a partir de IgG ou soro do hospedeiro do anticorpo da proteína-alvo. Os resultados do anticorpo da proteína-alvo são comparados com os controlos positivos e negativos para se tirar as conclusões corretas.
Se a proteína alvo não tiver um anticorpo comercial adequado para ensaios de imunoprecipitação de cromatina e apenas anticorpos para outros fins estiverem disponíveis, pode-se realizar primeiro um teste de imunoprecipitação de proteínas. Se o anticorpo conseguir precipitar a proteína com sucesso, então o ensaio de imunoprecipitação de cromatina será realizado.

Quais são os fatores que levam a falsos positivos em ChIP-Seq?

A sequenciação de alto rendimento melhora significativamente a resolução dos ensaios de ChIP, mas não é o único determinante da alta resolução. O comprimento dos fragmentos de cromatina interrompidos após a imunopurificação também afeta a resolução. Métodos de fragmentação de DNA, acessibilidade da cromatina, viés de amplificação por PCR, duplicação do genoma e erros na sequenciação e alinhamento de sequências podem introduzir erros sistemáticos que causam falsos positivos.

Quais métodos de processamento de dados podem ser utilizados para estimar a fiabilidade dos dados brutos de ChIP-seq?

Após o sequenciamento, as sequências são primeiro comparadas com genomas conhecidos e os verdadeiros locais de ligação (picos) são estabelecidos. Para fatores de transcrição, são procurados os genes reguladores a jusante (genes-alvo) correspondentes aos "picos", ou são construídas sequências de ligação conservadas para os locais de ligação dos fatores de transcrição, e se os motivos dos fatores de transcrição forem conhecidos, pode-se calcular a percentagem dos "picos" que contêm as sequências de motivos. Se o motivo do fator de transcrição for conhecido, pode-se calcular a percentagem de sequências de motivos na sequência do "pico", o que pode estimar indiretamente a fiabilidade dos resultados experimentais.

Preciso realizar ensaios de qPCR após ChIP?

Um ensaio de qPCR é geralmente realizado após a conclusão do ChIP. Se estiver a estudar modificações de histonas, então é necessário um gene que seja modificado pela histona, mas não afetado pela modificação da histona, como controlo para a qPCR. Um ploidia de enriquecimento elevado (tratamento/input) do gene indicará um enriquecimento significativo do ChIP. Se o estudo se centrar em fatores de transcrição, podem ser desenhados vários pares de primers para genes-alvo potenciais, em relação às suas regiões gênicas e regiões promotoras, para testar a especificidade do enriquecimento do ChIP.

Qual é a diferença entre esferas de agarose e esferas magnéticas durante a imunoprecipitação, e quais esferas são mais eficazes?

As esferas de agarose têm ligação não específica e, portanto, precisam ser pré-lavadas com cromatina para remover proteínas ou ADN que possam estar ligadas de forma não específica à agarose de proteína G, e a estratificação não é óbvia, resultando na fácil perda de amostras. A vantagem das esferas magnéticas é que a amostra não precisa ser centrifugada, o tempo de operação é curto, e a superfície das esferas é lisa e o fundo é baixo, eliminando assim a necessidade de contenção. Outra vantagem das esferas magnéticas é que são codificadas por cores e têm uma estratificação clara, de modo que a amostra não se perca, mas requerem um suporte magnético.

Preparação de Amostras

Quais são os requisitos de amostra para ChIP-Seq?

Como extrair núcleos celulares para ChIP-Seq?

Para evitar a ruptura da membrana nuclear, um grande número de fragmentos genómicos pode ser perdido. Para extrair núcleos, precisamos prestar atenção aos seguintes aspetos: em primeiro lugar, precisamos construir um sistema de tampão adequado para manter o equilíbrio da pressão osmótica da membrana nuclear; em segundo lugar, precisamos controlar a velocidade de rotação durante a centrifugação para evitar a ruptura da membrana nuclear; em terceiro lugar, precisamos marcar os núcleos com corantes fluorescentes para detectar a integridade dos núcleos após a extração.

Quais são os requisitos de amostras de células animais para ChIP-Seq?

Preciso de fazer eletroforese das amostras de ADN para experiências de ChIP-Seq?

A eletroforese é necessária para (1) testar o efeito da fragmentação ultrassónica, a fragmentação ChIP requer entre 100bp-900bp, demasiado curta para garantir a integridade da região de ligação da histona/fator de transcrição, perdendo parte da informação, demasiado longa para conter a região não alvo, resultando em falsos positivos; (2) testar a integridade do DNA genómico, para a fragmentação ultrassónica, o DNA da amostra deve apresentar uma única banda de DNA genómico intacto.

Quais são as considerações para a fragmentação ultrassónica em experiências de ChIP?

(1) Ao utilizar um instrumento de fragmentação ultrassónica baseado em sonda, selecione uma sonda que seja apropriada para o volume da sua amostra.
(2) Em qualquer caso, os parâmetros de cisalhamento devem ser otimizados para o seu volume de amostra, densidade celular e tipo de célula.
(3) A otimização deve incluir definições de potência (tempo de sonicação vs. tempo de intervalo/tempo de descanso) e o número de ciclos de cisalhamento necessários para obter fragmentos de ADN com comprimento entre 200-1000 bp, otimizando apenas um parâmetro por experimento de otimização.
(4) Preste atenção às configurações de tempo e potência. A fragmentação excessiva e configurações de potência demasiado altas podem danificar os epítopos na etapa de imunoprecipitação.
(5) Mantenha sempre o lisado bem frio e sonifique intermitentemente em vez de continuamente, uma vez que o calor gerado pela sonificação pode desnaturar a cromatina.
(6) Evite bolhas de ar durante a fragmentação por sonicação. As bolhas causam desnaturação da superfície da proteína e podem provocar a perda de cromatina nas bolhas. Para evitar isso, ajuste a potência para um nível mais baixo inicialmente e, em seguida, aumente-a gradualmente.