Uma Visão Geral das Tecnologias de Genotipagem de SNPs

Um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) representa uma variação em um único nucleotídeo que ocorre numa posição específica no genoma. Os SNPs são os principais contribuintes para as variações de DNA entre indivíduos, com uma frequência de aproximadamente um em 1.000 bp. Sugere-se que os SNPs sejam responsáveis por diferenças fenotípicas e que afetem o desenvolvimento e a progressão de várias doenças, bem como determinem a resposta ao tratamento medicamentoso e/ou ao stress ambiental. Além disso, os SNPs podem servir como marcadores moleculares ideais para identificar genes associados a características biológicas importantes e doenças. Portanto, o perfilamento de SNPs é considerado de grande importância na reprodução seletiva, na produção agrícola e na produtividade, na medicina personalizada e no tratamento medicamentoso.

O que é genotipagem de SNP?

Genotipagem de SNPs refere-se à determinação de loci SNP em uma escala de genoma completo ou dentro de regiões genómicas de interesse. As principais aplicações da genotipagem de SNPs estão no tratamento de doenças e em estudos de farmacogenómica. Um grande número de tecnologias e plataformas comerciais foram desenvolvidas para a genotipagem de SNPs. De acordo com o propósito da pesquisa, a genotipagem de SNPs pode ser dividida em duas categorias: associação de genoma completo (AGC) e mapeamento finoAs abordagens comuns para genotipagem de SNP incluem microarrays de SNP, Genotipagem de SNP TaqMan, Genotipagem de SNPs MassARRAYe sequenciação de alto rendimento. Com o rápido desenvolvimento das tecnologias de genotipagem de SNPs, um grande número de bases de dados públicas foram estabelecidas para coletar SNPs identificados (Tabela 1).

Tabela 1. Bases de dados de SNP.

1. Microarranjos SNP

As matrizes disponíveis comercialmente para genotipagem de SNPs incluem principalmente as plataformas Affymetrix e Illumina. Os princípios de ambas as plataformas estão descritos na Figura 1. As soluções de genotipagem da Affymetrix e Illumina oferecem um desempenho confiável em relação à medicina de precisão, genotipagem agrícola, forense, estudos em larga escala de populações e estudos de associação genômica (GWAS). Os chips de SNP de alta densidade disponíveis comercialmente cobrem a maior parte do genoma humano e de outras plantas e animais de importância económica. Alternativamente, chips semi-personalizados e personalizados permitem que os investigadores escolham os marcadores desejados.

Figura 1. Visão geral da tecnologia de arrays de SNP (laframboise 2009). (a) Nos ensaios da Affymetrix, existem sondas para ambos os alelos e o DNA liga-se a ambas as sondas, independentemente do alelo que transporta. A ligação impedida manifesta-se num sinal mais fraco. (b) Nos ensaios de beadarray da Illumina, uma pérola contém uma sequência complementar à sequência adjacente aos loci SNP. Quando se liga ao DNA, exibe cores diferentes.

2. Genotipagem de SNP TaqMan

Genotipagem de SNP TaqMan fornece uma forma rápida e simples de analisar locais SNP. Os ensaios de genotipagem SNP TaqMan agora incluem mais de 17 milhões de coleções pré-projetadas para uso em formatos de instrumentos de PCR em tempo real de 48, 96, 384 e OpenArray. Cada coleção pré-projetada inclui duas sondas TaqMan MGB específicas para alelos, rotuladas com corantes fluorescentes distintos, e um par de primers de PCR. Elas alinham-se de forma única ao DNA para oferecer alta especificidade para o alelo de interesse. Um corante reportador 5' e um corante quencher 3' estão ligados covalentemente às sondas. Quando as sondas estão intactas, a fluorescência é suprimida. Durante a extensão da PCR, a atividade exonuclease ocorre apenas nas sondas perfeitamente emparelhadas. Os corantes reportador e quencher são então liberados devido à atividade exonuclease. O sinal fluorescente é medido para determinar o genótipo da amostra.

Figura 2. O princípio da genotipagem SNP TaqMan.

3. Genotipagem de SNPs MassARRAY

A plataforma MassARRAY tem várias vantagens para os utilizadores que desejam um ensaio de genotipagem de SNP personalizado e preciso. Utiliza um único primer de extensão para gerar produtos específicos de alelos para todos os locais de PCR, garantindo uma única mistura de terminação. O ensaio baseia-se na extensão de primers e envolve uma reação de extensão de primer específica para o locus e uma reação de extensão de primer específica para o locus (ensaio iPLEX). No ensaio iPLEX, um primer oligonucleotídico se anexa imediatamente a montante do local SNP que está a ser genotipado. A extensão do primer ocorre então, que é uma única base modificada em massa complementar. A massa dos produtos estendidos é determinada utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF. Genotipagem de SNPs MassARRAY pode analisar múltiplos locais SNP numa única reação. Este método é preciso e tem uma vantagem de preço ao analisar dezenas ou centenas de SNPs.

Figura 3. Os passos na genotipagem utilizando o sistema MassARRAY iPLEX (Svidnicki et al. 2015). (a) Reação de amplificação específica de locus. (b) A enzima SAP neutraliza os dNTPs não incorporados. (c) Assay iPLEX. (d) Os produtos são analisados pelo método MALDI-TOF. (e) Análise de dados.

Análise de SNP por sequenciação de alto rendimento

O sequenciamento do genoma humano identificou mais de 3,1 milhões de SNPs validados. As bases de dados de SNPs desenvolvidas fornecem informações valiosas para o desenho de estudos de associação e interpretação de dados. O sequenciamento é uma abordagem poderosa e de alto rendimento para genotipagem de SNPs, e foram desenvolvidos vários métodos baseados em sequenciamento para análise de SNPs, como genotipagem por sequenciação (GBS)A análise de SNP por meio de sequenciação de nova geração (NGS) geralmente envolve a geração de um produto de DNA específico de regiões genómicas selecionadas, seguido de sequenciação direta. Com a redução do custo da sequenciação, a sequenciação de nova geração (por exemplo, Illumina, Roche 454, Ion Torrent) e a sequenciação de terceira geração (por exemplo, Nanopore, PacBio SMRT) estão a tornar-se amplamente disponíveis.

Referências:

1. Svidnicki M C C C C M, Silva-Costa S M, Ramos P Z, et al.Triagem de alterações genéticas relacionadas com a perda auditiva não sindrómica utilizando a tecnologia MassARRAY iPLEX®. BMC genética médica, 2015, 16(1): 85.
2. Gabriel S, Ziaugra L, Tabbaa D. Genotipagem de SNPs utilizando a plataforma Sequenom MassARRAY iPLEX. Protocolos atuais em genética humana, 2009, 60(1): 2.12. 1-2.12. 18.
3. Komar A A. Polimorfismos de nucleótido único. Métodos em Biologia Molecular, 2009, 578.