Diretrizes para Submissão de Amostras
Perguntas e Respostas sobre Sequenciação de RNA de Célula Única
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Questões Gerais
- Quais são as características do RNA de célula única rotulado da 10X Genomics?
- A 10X Genomics rotula células individuais de RNA com cauda A (o primer de transcrição reversa 10X é olig dT), incluindo mRNA rotulado e lncRNA.
- Posso fazer sequenciação de circRNA através da sequenciação de célula única da 10X Genomics?
- As células únicas da 10X Genomics não conseguem rotular circRNA, portanto não é possível fazer circRNA a partir de células únicas da 10X.
- Como posso obter genes marcadores na sequenciação do transcriptoma de células únicas?
- 1) cellmarker: incluindo 13.605 genes marcadores para 467 tipos de células de 158 grupos (sub-tecidos) em humanos, e 9.148 genes marcadores para 389 tipos de células de 81 tecidos (sub-tecidos) em ratos.
2) revisão da literatura
3) especulação sobre a expressão de genes regulados positivamente em subpopulações
4) genes homólogos de espécies estreitamente relacionadas
5) A própria base de dados de sequenciação de células únicas da CD Genomics
- 1) cellmarker: incluindo 13.605 genes marcadores para 467 tipos de células de 158 grupos (sub-tecidos) em humanos, e 9.148 genes marcadores para 389 tipos de células de 81 tecidos (sub-tecidos) em ratos.
- Em quais projetos de sequenciação do transcriptoma de células únicas você esteve envolvido?
- Ajudámos vários clientes com os seus projetos, estudos de heterogeneidade celular, desenvolvimento e diferenciação, resposta imunitária, descoberta de novas células, estudos a nível celular de edição genética direcionada, tipificação de doenças, construção de atlas celulares, etc.
- Qual é a diferença entre a captura do 5'-end e a captura do 3'-end na construção de bibliotecas de sequenciamento de células únicas?
- Existem dois métodos principais para o sequenciamento do transcriptoma de células únicas da 10x Genomics: construção de bibliotecas da extremidade 5' e da extremidade 3'. Para a construção da biblioteca da extremidade 3', a sequência terminal das esferas de gel é poli(dT), que é utilizada para emparelhamento complementar com a estrutura poliA na extremidade 3' do transcriptoma. Enquanto na construção da biblioteca da extremidade 5', as sequências terminais das esferas de gel são sequências de oligonucleotídeos de troca com estruturas poliG no final. O transcriptoma adicionará a estrutura poliC na sua extremidade 5' pela ação da enzima, completando assim o emparelhamento.
- Por que é que o método de captura da extremidade 5' é geralmente utilizado para VDJ?
- O método de captura para a construção da biblioteca VDJ é fixado pelo método de captura da extremidade 5', de forma a enriquecer a região variável VDJ na extremidade 5' enquanto mantém o comprimento da sequência curto, em vez da região C mais conservadora na extremidade 3', que geralmente não é o foco da investigação.
- Que análise de associação pode ser feita para sequenciação do transcriptoma de células únicas e sequenciação ATAC de células únicas?
- 1) Associação de subpopulações, mapeando diretamente subpopulações do transcriptoma para subpopulações celulares ATAC.
2) Associação de regiões genómicas abertas e expressão génica a jusante.
3) A associação da relação temporal das regiões abertas e a relação temporal da expressão génica.
- 1) Associação de subpopulações, mapeando diretamente subpopulações do transcriptoma para subpopulações celulares ATAC.
- Como escolher a profundidade do sequenciamento de RNA de célula única?
- A profundidade do sequenciamento do transcriptoma de células únicas não é muito diferente do sequenciamento normal do transcriptoma. Existem cerca de 10-14.000 espécies de expressão génica numa única célula, mas o número total de todos os genes detetados num lote de sequenciamento de células únicas muitas vezes excederá 20.000. Um estudo que comparou dados da mesma célula com 180M e 50M de leituras mostrou um alto grau de concordância. Além disso, a profundidade do sequenciamento determina a "resolução", e foi demonstrado que o sequenciamento de células únicas pode distinguir efetivamente um grupo de células com padrões de expressão próximos a aproximadamente 10.7 lê.
- Quantas células podem ser medidas de cada vez pela sequenciação do transcriptoma de célula única?
- A sequenciação do transcriptoma de células únicas é equipada com um chip microfluídico de 8 canais, que pode medir 8 amostras ao mesmo tempo, cada canal pode medir entre 100 a 10.000 células, um chip pode obter entre 100 a 80.000 células simultaneamente.
- Quão eficiente é a captura de transcriptoma de célula única? Haverá múltiplas células capturadas?
- Em condições experimentais normais, a eficiência de captura de células únicas é tão alta quanto 65%; a probabilidade de capturar múltiplas células é extremamente baixa, cerca de 0,9% em 1000 células.
- Qual é a quantidade típica de dados obtidos de uma única célula?
- A recomendação oficial é de 50 mil leituras por célula. O número de genes expressos numa célula varia bastante de tecido para tecido, e a quantidade final de dados medida terá de ser analisada caso a caso.
Para alguns tecidos e células, pode ser aumentado para 100 K leituras/célula; no entanto, uma profundidade de sequenciação demasiado alta também pode trazer mais ruído e dificultar a análise de dados subsequente. Ao utilizar a estratégia Illumina PE150 (sequenciação de extremidade dupla), se a captura padrão for de cerca de 8K células, a quantidade de dados de sequenciação para uma amostra é tipicamente 120 Gbase/amostra (8000 x 50K x 150 x 2 / 10).nove = 120 Gbase).
- A recomendação oficial é de 50 mil leituras por célula. O número de genes expressos numa célula varia bastante de tecido para tecido, e a quantidade final de dados medida terá de ser analisada caso a caso.
- Que tipos de análise podem ser utilizados a partir do sequenciamento de scRNA?
- O processo de análise padrão inclui o controlo de qualidade dos dados de sequenciação e estatísticas de vários índices (número de células, número de genes detetados, volume de dados medido por células individuais, etc.), quantificação da expressão génica, classificação de tipos celulares, triagem de genes diferencialmente expressos e anotação funcional, entre outros. Além disso, pode ser realizada uma análise personalizada com base no contexto do projeto e no desenho experimental.
- Quais preferências existem na sequenciação de RNA de célula única?
- - Preferências de amplificação
- Taxas de abandono: Alguns mRNAs altamente expressos não podem ser amplificados.
- Explosão transcricional
- Ruído de fundo
- Preferências devido ao ciclo celular e ao tamanho celular
- Efeito de lote
- - Preferências de amplificação
- O que é importante notar sobre a etapa de transcrição reversa na sequenciação de scRNA?
- A eficiência da transcriptase reversa é crítica.
As taxas de abandono estão tipicamente na faixa de 60% a 90%.
As taxas de abandono podem variar bastante entre duas bibliotecas diferentes, se as mesmas linhagens celulares forem tratadas com o mesmo método.
- A eficiência da transcriptase reversa é crítica.
- O que procurar nos passos do processo de amplificação na sequenciação de scRNA?
- Qualquer etapa de amplificação pode levar a preferências.
2) Muitos métodos de sequenciação de transcriptomas de células únicas têm uma métrica de códigos de barras moleculares para nos ajudar a corrigir as preferências de amplificação.
3) Transcrições completas como o SmartSeq2 não possuem códigos de barras moleculares e, portanto, não podem ser corrigidas para preferências de amplificação usando o método de códigos de barras moleculares.
- Qualquer etapa de amplificação pode levar a preferências.
- Quais são os pontos de controlo de qualidade na sequenciação de scRNA?
- • Taxa de emparelhamento única
• Proporção de correspondências em regiões exónicas
• Preferência de 3' em transcritos completos de célula única
• Lê pares de mRNA
• Rácio de códigos de barras/moléculas
• Número de genes detetados
• Detecção de RNA Spike-in
• Rácio de RNA mitocondrial e ribossómico
- • Taxa de emparelhamento única
- Qual é o problema se houver poucas sequências de RNA spike-in?
- Se houver poucas sequências de RNA spike-in, isso pode ser uma indicação direta de uma falha na construção da biblioteca. Se o spike-in for normal, mas a célula tiver poucas sequências de RNA, pode ser porque a própria célula é muito pequena ou a célula está danificada antes da construção da biblioteca.
- Qual é o problema se os resultados de sequenciação de scRNA encontrarem alta RNA mitocondrial?
- Se o RNA mitocondrial estiver demasiado elevado, isso também indica que há uma ruptura celular. Isto porque, quando a célula está rompida, o RNA citoplasmático escapa, mas o RNA mitocondrial não se derrama porque está envolto pela membrana mitocondrial. Portanto, quando há uma ruptura na membrana celular, a percentagem de RNA mitocondrial será alta.
- Qual é o problema se uma alta percentagem de RNA ribossomal for encontrada nos resultados de sequenciação de scRNA?
- Quando a percentagem de RNA ribossómico é elevada, pode ser porque há uma grande quantidade de degradação de RNA na célula. No transcriptoma de célula única de comprimento total, a preferência por 3' pode ser utilizada para detectar a presença de uma elevada quantidade de degradação de RNA na célula.
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Preparação de Amostras
- O que devo fazer se tender a formar aglomerados durante a preparação de suspensões de células únicas?
- 1) Adicione algumas gotas de DNAse estéril (1mg/ml dissolvido em água) à suspensão celular para quebrar as cadeias de DNA. Sopre suavemente sobre as células para evitar danos físicos à membrana celular.
2) Encontre o tempo apropriado para a digestão enzimática.
3) Lave as células com uma solução salina equilibrada isenta de cálcio e magnésio, podendo ser adicionado EDTA com uma concentração de até 2 mM.
4) É melhor não agitar vigorosamente durante a digestão, para que as células estejam especialmente propensas a desprender-se de forma escamosa.
- 1) Adicione algumas gotas de DNAse estéril (1mg/ml dissolvido em água) à suspensão celular para quebrar as cadeias de DNA. Sopre suavemente sobre as células para evitar danos físicos à membrana celular.
- Como preparo amostras para sequenciação do transcriptoma de células únicas?
- As amostras utilizadas para sequenciação do transcriptoma de células únicas são diferentes nas células animais e nas células vegetais. As células animais precisam ser tratadas com suspensões de células únicas e as células vegetais precisam ser tratadas com protoplastos. Amostras frescas geralmente requerem uma viabilidade celular de 90% ou mais, sem a presença de inibidores da transcrição reversa e moléculas de ácidos nucleicos não celulares.
- Por que é que a viabilidade celular exigida após a preparação da suspensão de células únicas é tão alta?
- Porque o RNA de células mortas será libertado dentro do fluido extracelular ou misturado com o GEM de células vivas. Este RNA livre pode ser envolvido pelas células e afetar a reação subsequente, o que eventualmente leva a resultados de análise imprecisos. Ao mesmo tempo, o elevado número de células mortas também levará a uma estimativa imprecisa do número de células e afetará a taxa de captura.
Apenas para fins de investigação, não se destina a diagnóstico clínico, tratamento ou avaliações de saúde individuais.
