Protocolo de Sequenciação de Receptores B-Celulares Baseado em NGS

Amplificação de VH-Cg, VH-Ca ou VH-Cμ a partir de cDNA

1. Prepare a mistura mestre de PCR consistindo em 28,3 μl de água, 5 μl de Buffer Gold 10×, 3 μl de MgCl2, 0,5 μl de dNTPs, 1 μl de BSA e 0,2 μl de Taq Gold.
2. Transfira a mistura mestre de PCR para os tubos de reação de PCR (38 μl em cada poço).
3. Deposite 1 μl de cada primer no poço correspondente.
4. Adicione 5 μl de cDNA no poço correspondente e coloque cuidadosamente a tampa dos tubos de PCR.
5. Execute a PCR a 95 °C por 7 min; 25–35 ciclos a 94 °C por 30 s, 57 °C por 30 s, 72 °C por 1 min; 72 °C por 10 min.
6. Carregue 50 μl do produto de PCR com 10 μl de corante de carregamento em um gel de agarose a 1% em tampão TBE contendo brometo de etídio e execute por 1 h a 180 V.
7. Visualize a banda de DNA sob luz ultravioleta (UV) e corte a banda de PCR de aproximadamente 500 bp do gel usando um escalpelo.
8. Purifique o produto de PCR do gel usando o kit de extração de gel. Siga as instruções no manual e elua com 20 μl de tampão de eluição.
9. Continue com o Subtítulo 3.3, PCR Aninhada.

Amplificação de VH-JH a partir de DNA

1. Prepare a mistura mestre de PCR consistindo em 31,3 μl de água, 5 μl de Buffer Gold 10×, 3 μl de MgCl2, 0,5 μl de dNTPs, 1 μl de BSA e 0,2 μl de Taq Gold.
2. Transfira a mistura mestre de PCR para os tubos de reação de PCR (41 μl em cada poço).
3. Deposite 1 μl de cada primer (6 primers 5′ e 1 primer Cg ou Ca por poço) no poço correspondente.
4. Adicione 2 μl de DNA a 50 ng/μl no poço correspondente e coloque cuidadosamente a tampa dos tubos de PCR.
5. Execute a PCR a 95 °C por 7 min; 25–35 ciclos a 94 °C por 30 s, 57 °C por 30 s, 72 °C por 1 min; 72 °C por 10 min.
6. Carregue 50 μl do produto de PCR com 10 μl de corante de carregamento em um gel de agarose a 1% em tampão TBE contendo brometo de etídio e execute por 1 h a 180 V.
7. Visualize a banda de DNA sob luz ultravioleta (UV) (veja a Nota 7) e corte a banda de PCR de aproximadamente 500 bp do gel usando um escalpelo.
8. Purifique o produto de PCR do gel usando o kit de extração de gel. Siga as instruções no manual e elua com 20 μl de tampão de eluição.

PCR Aninhada e Agrupamento

1. Adicione 12,5 μl de KAPA HiFi Hotstart Ready mix, 2 μl de primer direto TruSeq Custom Amplicon, 2 μl de primer reverso TruSeq Custom Amplicon e 8,5 μl de produto de PCR purificado a um tubo de reação de PCR.
2. Execute a PCR a 95 °C por 5 min; 10 ciclos a 98 °C por 20 s, 66 °C por 30 s, 72 °C por 30 s; 72 °C por 1 min.
3. Meça a concentração dos produtos de PCR.
4. Misture o produto de PCR a uma concentração equimolar de 50 mM.
5. Purifique o agrupamento dos produtos de PCR.
6. O agrupamento de PCR pode ser sequenciado usando a plataforma Illumina.

Mesclagem, Corte e Alinhamento de Leituras Usando Galaxy

1. A sequenciação com a plataforma Illumina resulta em leituras R1 e R2 que precisam ser mescladas antes de poderem ser alinhadas a uma base de dados de referência.
2. Após as leituras serem mescladas, os adaptadores de primers Illumina Rd1 e Rd2 devem ser removidos das leituras, assim como os primers diretos.
3. Antes que as leituras possam ser alinhadas usando IMGT/HighV-Quest, os arquivos FASTQ devem ser adaptados ao formato de arquivo FASTA. Isso pode ser feito com o conversor de FASTQ para FASTA.
4. Para alinhamento e anotação das rearrumações de BCR, o sistema internacional ImMunoGeneTics IMGT/HighV-Quest pode ser utilizado.

Análise de Dados Usando o Pipeline de Repertório Imune no Antigen Receptor Galaxy

1. Abra o ARGalaxy.
2. Carregue os arquivos .txz comprimidos usando: obter dados → carregar arquivo. O arquivo aparecerá no lado direito da sua tela sob "Histórico."
3. Selecione sob "Ferramentas" no lado esquerdo da tela "ARGalaxy" e clique no "pipeline de repertório imune."
4. Selecione o arquivo .txz que você gostaria de analisar.
5. Insira um nome no campo "ID".
6. Selecione a definição do clonótipo.
7. Selecione a ordem em que os genes V, D e J devem aparecer nos gráficos. A configuração padrão é em ordem alfabética e não na ordem em que aparecem no locus IGH.
8. Selecione "IGH" no campo "Locus".
9. Escolha se deseja visualizar as rearrumações não produtivas nos gráficos.
10. Selecione se deseja identificar sequências sobrepostas entre diferentes replicados dentro de um doador.
11. Pressione executar. Um novo item será exibido no seu histórico e ficará verde quando a ferramenta estiver pronta para processar os dados.
12. Clique no símbolo do "olho" para abrir a tabela que mostra uma visão geral das rearrumações, incluindo a porcentagem de produtivas, únicas produtivas, não produtivas e únicas não produtivas.
13. Pressione "Clique aqui para os resultados" para abrir a página com as diferentes abas de análise.
14. A aba "Frequências de genes" mostra a porcentagem de uso dos genes V, D e J. A frequência dos diferentes genes V, D e J varia ligeiramente entre indivíduos e também entre diferentes conjuntos de primers que são usados para amplificar as rearrumações de BCR.
15. A aba "Características do CDR3" contém gráficos que mostram a distribuição do comprimento do CDR3 e a frequência dos diferentes aminoácidos usados no CDR3. O comprimento mediano do CDR3 é maior em células B naïve em comparação com células B de memória, o que provavelmente é causado pela seleção contra comprimentos longos de CDR3, pois estes têm maior probabilidade de serem autorreativos.
16. Na aba "Mapas de calor", a frequência das diferentes combinações de genes V-J, V-D e D-J é visualizada em mapas de calor.
17. Na aba "Comparar mapas de calor", os mapas de calor entre diferentes doadores podem ser comparados.
18. Na aba "Circos", a frequência das diferentes combinações de genes V-J, V-D e D-J é visualizada usando gráficos circulares.
19. Quando a opção é escolhida para determinar o número de sequências que compartilham o mesmo tipo clonal entre replicados ou para determinar a clonalidade do doador, a aba "Tipos Clonais Compartilhados" ou "Clonalidade" é exibida. Essas abas incluem uma tabela com informações sobre o número de rearrumações de BCR que estão presentes em múltiplos replicados do mesmo doador. Quando três replicados estão presentes e a opção "determinar a clonalidade do doador" é escolhida, o escore de clonalidade baseado na publicação de Boyd et al. é fornecido. Em pacientes com IEI, a diversidade do repertório é frequentemente reduzida.
20. A aba "Análise de Junções" contém uma tabela com o número mediano ou médio de deleções, nucleotídeos palindrômicos (P) ou nucleotídeos não templados (N) nas rearrumações produtivas e não produtivas. Defeitos genéticos na via de união de extremidades não homólogas (NHEJ) demonstraram afetar o número de deleções, nucleotídeos N e nucleotídeos P.
21. Na aba "Download", todos os dados usados para criar as tabelas e gráficos podem ser baixados.

Referência:

1. Schouwenburg P A, Burg M, IJspeert H. Análise do repertório de receptores B baseada em NGS Análises de repertório no contexto de erros inatos de imunidade[M]//Imunogenética. Humana, Nova Iorque, NY, 2022: 169-190.