Protocolo de Extração e Validação de MicroRNA Extracelular

Coleta de Fluídos Corporais

1. Cole e processe as amostras da mesma maneira durante todo o estudo. Em caso de doenças específicas de género ou coortes de um único género, utilize as amostras de controlo do mesmo género. Se for possível o emparelhamento por idade, utilize as amostras de pacientes da mesma ou semelhante idade.
2. Prefira utilizar tubos de estabilização ou outros químicos de estabilização para a coleta de amostras, a fim de interromper a atividade da RNase nas amostras. A coleta de amostras em tubos de estabilização deve ser feita o mais rapidamente possível.
3. Colete as amostras dentro do mesmo intervalo de horário diurno, idealmente de manhã. Utilize a urina do segundo jato da manhã. Evite usar a urina do primeiro jato da manhã.
4. As amostras pré-cirúrgicas/diagnósticas devem ser coletadas antes da cirurgia (e da aplicação de tratamento). Considere que todos os medicamentos aplicados aos pacientes durante a coleta podem afetar os resultados.
5. Armazene as amostras coletadas em tubos de estabilização, a uma temperatura ambiente ou entre 6 °C e 12 °C (preferencialmente) por até 1 mês antes de processamento adicional. Não congele.
6. No caso de outras técnicas de coleta, particularmente sem reagentes de estabilização, deve ser aplicado um processamento imediato da amostra (centrifugações e isolamento de RNA e armazenamento a -80 °C).

Separação da Fração Extracelular

1. Aplique duas centrifugações consecutivas, a 430 × g (ou até 1000 × g) durante 20 min à temperatura ambiente e a 2000 × g (ou até 2500 × g) durante 10 min a 4 °C. Evite usar forças de centrifugação mais fortes, pois estas podem eliminar uma parte dos exossomas ou outras vesículas que transportam miRNAs. Este passo de duas centrifugações é necessário para eliminar células e plaquetas (sangue, ascite), ou os potenciais precipitados e contaminação de detritos celulares/bacterianos (urina).
2. Transfira as frações extracelulares (supernatantes) para tubos limpos para PCR, congele e armazene as amostras a -25 °C a curto prazo ou a -80 °C a longo prazo.
3. Inspecione a hemólise nas amostras de plasma/ascite, pois isso ocorre frequentemente em amostras de câncer ou em caso de coleta de sangue subótima. Amostras hemolíticas devem ser evitadas (ou tratadas separadamente), pois os miRNAs derivados de eritrócitos podem afetar os resultados. Isso aplica-se também no caso de amostras de urina que contenham glóbulos vermelhos e em que tenha ocorrido hemólise.

Isolamento de RNA Total

1. Utilize alíquotas de amostras congeladas, idealmente de um volume idêntico, por exemplo, 2 mL, e descongele-as à temperatura ambiente. Não remova os potenciais precipitados nas amostras de urina após o descongelamento, pois podem conter miRNAs ligados a proteínas. No entanto, não utilize os detritos avermelhados no fundo do tubo nas amostras de plasma.
2. Prossiga para isolar o RNA total.
3. Utilize o Kit de Purificação de RNA Circulante e Exossomal de Plasma/Serum Maxi para isolamento de RNA a partir de plasma e o Kit de Purificação de RNA Total de Urina Maxi (Formato Slurry) para isolamento de RNA a partir de urina. Alternativamente, utilize qualquer um dos kits comercialmente disponíveis para isolamento de RNA total, garantindo a isolação de pequenos RNAs. Armazene o RNA total isolado (e alíquotado) a -80 °C.

Validação de MiRNAs Individuais

1. Realize uma transcrição reversa do RNA total para cDNA utilizando o Kit de Transcrição Reversa TaqMan MicroRNA e primers específicos de miRNA em formato de stem-loop. Em vez de reações em grande escala, podem ser utilizadas reações reduzidas de até um terço ou metade dos volumes de entrada originais recomendados de todos os reagentes e RNA. Além disso, pode ser aplicada uma quantidade aumentada de RNA, substituindo o volume de ddH₂O, a fim de melhorar os valores de Ct resultantes em amostras com baixa concentração de RNA. Utilize o mesmo volume de RNA de entrada para todas as amostras no experimento.
2. Prepare a mistura de reação sobre gelo. Em reações reduzidas (7,5 μL), cada reação deve conter 2,08 μL de água livre de nucleases (ddH₂O), 0,75 μL de tampão de transcrição reversa 10×, 0,095 μL de Inibidor de RNase (20 U/μL), 0,075 μL de dNTPs 100 mM com dTTP e 0,5 μL de Transcriptase Reversa MultiScribe (50 U/μL), preparada em grande volume como uma mistura mestre. Para cada mistura mestre específica de miRNA, adicione 1,5 μL de primer RT (5×) e, finalmente, adicione 2,5 μL da amostra de RNA específica para cada reação. Misture suavemente por inversão (não vortex) e centrifugue brevemente.
3. Em um termociclador, realize a reação de transcrição reversa em tubos de PCR de 0,2 mL com as seguintes condições: 16 °C por 30 min, 42 °C por 30 min e 85 °C por 5 min. Mantenha a 4 °C. O produto da RT (cDNA) pode ser armazenado a -25 °C por pelo menos 2 semanas antes da qPCR.
4. Utilize placas de PCR de 96 poços de acordo com o ciclista de qPCR, três poços por amostra, ou seja, uma amostra em triplicado.
5. Combine as amostras de diferentes grupos comparados (por exemplo, câncer vs controles) em uma única placa quando possível, idealmente para os miRNAs investigados e também os controles endógenos necessários para normalização.
6. Controles sem template (apenas mistura mestre com primer específico sem cDNA) devem ser incluídos.
7. Realize reações de qPCR reduzidas (10 μL). Prepare uma pré-mistura de reação composta por TaqMan Universal PCR Master Mix (2×) ou Xceed qPCR Probe 2× Mix HI-ROX buffer (5 μL), água livre de nucleases (3,8 μL) e ensaio de RNA pequeno específico de miRNA (20×) (0,5 μL) (os volumes são por uma reação; três reações devem ser por amostra), incluindo volumes excedentes (15%) para perdas de pipetagem.
8. Alíquotar a pré-mistura de reação em tubos para reações em triplicado (ou seja, 32 μL com reserva); Adicione o produto de cDNA (7,5 μL) da transcrição reversa para cada amostra por pipetagem suave. Centrifugue brevemente.
9. Alíquotar 10 μL da pré-mistura com cDNA em triplicado para cada amostra na Placa de Reação Óptica MicroAmp de 96 Poços e selar. No caso de utilizar o Bio-Rad CFX Connect, use placas de PCR de 96 poços, não revestidas, e Filme de Selagem de Placa de PCR Microseal 'B'.
10. Centrifugue a placa (por exemplo, a 700 × g a 1300 × g) utilizando centrífuga e rotor apropriados (por exemplo, Eppendorf 5430) por 1,5 a 3 min.
11. Execute reações de PCR em tempo real utilizando um termociclador de qPCR (por exemplo, 7900HT Fast Real-Time PCR System ou Bio-Rad CFX Connect). Utilize os seguintes parâmetros do termociclador: 50 °C por 2 min e 95 °C por 10 min. Para 40 ciclos, utilize o seguinte: 95 °C por 15 seg e 60 °C por 1 min (ou 30 seg em modo rápido).