Protocolo de Sequenciação de Receptores B com Códigos de Barras Moleculares

Extração de RNA

1. Coleta de células: Transfira as células para um tubo apropriado e centrifugue por 5 minutos a 300 ×g. Remova o sobrenadante.
2. Homogeneizar e lisar a amostra adicionando 350 μL de tampão LBP ao pellet celular. Misturar as células com um tampão de lise é geralmente suficiente para uma lise completa.
3. Remover gDNA e filtrar o lisado: Coloque a Coluna de Remoção de gDNA NucleoSpin® (anel amarelo) num tubo de coleta de 2 mL, transfira o lisado homogeneizado para a Coluna de Remoção de gDNA NucleoSpin® e centrifugue durante 30 s a 11.000 × g. Descarte a coluna e continue com o fluido coletado.
4. Ajustar as condições de ligação do RNA: Adicione 100 μL da solução de ligação BS ao fluxo, e misture bem com uma vortexação moderada ou pipetando para cima e para baixo várias vezes. Após a adição da solução de ligação BS, um precipitado filamentoso pode tornar-se visível, o que não afetará a isolação do RNA. Certifique-se de desagregar qualquer precipitado misturando e carregue todo o precipitado na coluna, conforme descrito no passo seguinte. Não centrifugue o lisado após a adição da solução de ligação antes de o carregar na coluna, para evitar a formação de um pellet com o precipitado.
5. Ligar RNA: Transfira todo o lisado (~450 μL) para a Coluna NucleoSpin® RNA Plus (anel azul claro) pré-montada com um tubo de coleta. Centrifugue por 15 s a 11.000 × g.
6. Lavar e secar a membrana de sílica:
(a) Primeira lavagem: Adicione 200 μL de tampão WB1 à Coluna NucleoSpin® RNA Plus. Centrifugue por 15 s a 11.000 × g. Descarte o eluído com o tubo de coleta e coloque a coluna em um novo tubo de coleta de 2 mL.
(b) Segunda lavagem: Adicione 600 μL de tampão WB2 à Coluna NucleoSpin® RNA Plus. Centrifugue durante 15 s a 11.000 × g. Descarte o fluido coletado e coloque a coluna de volta no tubo de coleta.
(c) Terceira lavagem: Adicione 250 μL de tampão WB2 à Coluna NucleoSpin® RNA Plus. Centrifugue por 2 minutos a 11.000 × g para secar completamente a membrana. Coloque a coluna num tubo de coleta de 1,5 mL livre de nucleases.
7. Eluir RNA: Adicione 30 μL de H2O livre de RNase e centrifugue a 11.000 × g durante 1 minuto. Adicione mais 30 μL de H2O livre de RNase à coluna e centrifugue novamente a 11.000 × g durante 1 minuto.
8. Após a extração de RNA, se o tamanho da amostra não for limitante, recomendamos avaliar a qualidade do RNA total utilizando o Kit Agilent RNA 6000 Pico ou uma plataforma equivalente. Consulte o fabricante para instruções.

Síntese de cDNA de Primeira Cadeia

1. Descongele o Buffer da Primeira Cadeia à temperatura ambiente. Descongele o potenciador BCR, os códigos de barras moleculares SMART Oligo e o Primer dT no gelo. Vortexe suavemente cada reagente para misturar e centrifugue brevemente. Armazene todos os reagentes, exceto o Buffer da Primeira Cadeia, no gelo. Retire a transcriptase reversa SMARTScribe e o inibidor de RNase do congelador imediatamente antes de usar, centrifugue brevemente e armazene no gelo.
2. Pré-aqueça o ciclista térmico a 72 °C.
3. Em gelo, prepare amostras e controlos em tubos de PCR de parede fina livres de nucleases, placas ou tiras, adicionando os reagentes.
4. Misture suavemente por vortexação e, em seguida, centrifugue brevemente.
5. Incubar os tubos a 72 °C no termociclador com tampa aquecida pré-aquecido durante 3 min. Durante esta incubação, preparar a Mistura Mestre de RT.
6. À temperatura ambiente, prepare a Mistura Mestre RT.
7. Misture bem o RT Master Mix, pipetando suavemente para cima e para baixo, e depois centrifugue brevemente.
8. Imediatamente após a incubação de 3 minutos a 72 °C, coloque as amostras sobre gelo durante 2 minutos.
9. Reduza a temperatura do ciclista térmico para 42 °C.
Adicione 7,5 μL do RT Master Mix a cada tubo de reação. Misture o conteúdo de cada tubo pipetando suavemente e centrifugue brevemente.
11. Coloque os tubos num ciclista térmico com tampa aquecida, pré-aquecido a 42 °C. Execute o seguinte programa: 42 °C, 90 min; 70 °C, 10 s; manutenção a 4 °C.

Amplificação de Primeira Rodada

1. Descongele o tampão PrimeSTAR GXL 5×, a mistura de dNTP, os primers e a água livre de nucleases em gelo. Vortexe suavemente cada reagente para misturar e centrifugue brevemente. Armazene em gelo. Remova a polimerase de DNA PrimeSTAR GXL do congelador imediatamente antes de usar, pipete suavemente para misturar, centrifugue brevemente e armazene em gelo.
2. Prepare uma mistura mestre de PCR1 para cada cadeia de IgG/IgM/IgK/IgL de interesse, combinando os seguintes componentes na ordem indicada, em gelo. Vortex suavemente para misturar e centrifugar brevemente.
Adicione 46 μL do Master Mix PCR1 apropriado de IgG/IgM/IgK/IgL a uma placa/tubo PCR de 0,2 mL com parede fina e livre de nucleases.
4. Adicione 4 μL de cDNA de primeira cadeia da Subsecção 3.3 ao(s) tubo(s) correspondente(s) contendo o Master Mix PCR1. Vortexe suavemente para misturar e centrifugue brevemente.
5. Coloque a placa/tubo(s) num termociclador pré-aquecido com tampa aquecida e execute o seguinte programa (temperatura da tampa: 105 °C): 95°C 1 min; 98°C 10 s, 60°C 15 s, e 68°C 45 s (18 ciclos); 4°C em pausa.

Amplificação PCR de Segunda Rodada

1. Descongele o tampão 5X PrimeSTAR GXL, a mistura de dNTP, os primers e a água livre de nucleases sobre gelo. Vortexe suavemente cada reagente para misturar e centrifugue brevemente. Armazene sobre gelo. Remova a polimerase de DNA PrimeSTAR GXL do congelador imediatamente antes de usar, misture suavemente por pipetagem, centrifugue brevemente e armazene sobre gelo.
2. Para cada cadeia de IgG/IgM/IgK/IgL de interesse, prepare uma Mistura-Mestre de PCR2 combinando o seguinte na ordem mostrada, em gelo. Vortex suavemente para misturar e centrifugue brevemente.
3. Para cada reação, adicione 48 μL de Master Mix PCR2 ao(s) tubo(s)/placa de PCR de 0,2 mL, de parede fina e isentos de nucleases.
4. Adicione 1 μL do produto de PCR1 apropriado a cada tubo correspondente de PCR 2.
5. Adicione 1 μL do primer hBCR PCR2 Universal Forward 1–12 apropriado a cada amostra. Vortex suavemente para misturar e centrifugue brevemente.
6. Coloque a placa/tubo(s) num termociclador pré-aquecido com tampa aquecida e execute o seguinte programa (temperatura da tampa: 105 °C): 95°C 1 min; 98°C 10 s, 60°C 15 s, 68°C 45 s (X* ciclos); 4°C Manter.

Purificação de Bibliotecas Amplificadas

1. Vortex as esferas NucleoMag até estarem bem misturadas e, em seguida, adicione 25 μL das esferas NucleoMag a cada amostra.
2. Misture bem, pipetando suavemente todo o volume para cima e para baixo pelo menos dez vezes.
3. Incubar à temperatura ambiente durante 8 minutos para permitir que o DNA se ligue às esferas.
4. Gire brevemente as amostras para coletar o líquido do lado do tubo ou poço da amostra. Coloque as amostras no dispositivo de separação magnética durante cerca de 5 minutos ou mais, até que o líquido apareça completamente claro e não haja esferas restantes no sobrenadante. O tempo necessário para a solução ficar clara dependerá da força do íman.
5. Enquanto os tubos de reação estão a repousar no dispositivo de separação magnética, use uma pipeta para transferir o sobrenadante (que contém a sua biblioteca) para tubos de PCR limpos.
6. Remova os tubos contendo as esferas do dispositivo de separação magnética e deite-os fora.
Adicione 10 μL de esferas NucleoMag a cada tubo contendo sobrenadante.
8. Misture bem, pipetando suavemente todo o volume para cima e para baixo pelo menos dez vezes.
9. Incubar à temperatura ambiente durante 8 minutos para permitir que o DNA se ligue às esferas.
Coloque os tubos no dispositivo de separação magnética durante cerca de 10 min ou até que a solução esteja completamente clara.
11. Enquanto os tubos estiverem no dispositivo de separação magnética, remova o sobrenadante com uma pipeta e descarte-o.
12. Mantenha os tubos no dispositivo de separação magnética. Adicione 200 μL de etanol a 80% recém preparado a cada amostra, sem perturbar as esferas, para lavar os contaminantes. Aguarde 30 s e use uma pipeta para remover cuidadosamente o sobrenadante que contém contaminantes. A biblioteca permanecerá ligada às esferas durante o processo de lavagem.
13. Repita a lavagem com etanol (passo 12 desta secção) mais uma vez.
14. Gire brevemente os tubos (~2000 × g) para coletar o líquido restante no fundo de cada tubo. Coloque os tubos no dispositivo de separação magnética durante 30 s e, em seguida, remova todo o líquido restante com uma pipeta.
15. Deixe os tubos de amostra descansarem abertos no dispositivo de separação magnética à temperatura ambiente durante cerca de 2–2,5 minutos, até que o pellet apareça seco e não esteja mais brilhante. Pode ver uma pequena fissura no pellet.
16. Uma vez que o pellet de beads tenha secado, remova os tubos do dispositivo de separação magnética e adicione 17 μL de tampão de eluição para cobrir o pellet. Misture bem pipetando para cima e para baixo para garantir uma completa dispersão das beads.
17. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 5 minutos para reidratar.
18. Gire brevemente as amostras para coletar o líquido da lateral do tubo ou poço da amostra. Coloque as amostras de volta no dispositivo de separação magnética durante 2 minutos ou mais, até que a solução esteja completamente clara.
19. Transfira o sobrenadante claro contendo a biblioteca de BCR/IG purificada de cada tubo para um tubo de baixa adesão e livre de nucleases. Rotule cada tubo com as informações da amostra e armazene a −20 °C.

Sequenciação

1. Dilua cada biblioteca para 4 nM em água livre de nucleases. Para evitar erros de pipetagem, utilize pelo menos 2 μL de cada biblioteca original para a diluição.
2. Agrupe as bibliotecas diluídas combinando uma quantidade igual de cada biblioteca num tubo de 1,5 mL de baixa ligação. Misture por vortexação a baixa velocidade ou pipetando para cima e para baixo. Utilize pelo menos 2 μL de cada biblioteca diluída para evitar erros de pipetagem.
3. Utilize um alíquota de 5 μL das bibliotecas agrupadas com concentração de 4 nM. Siga o protocolo de desnaturação da biblioteca de acordo com a edição mais recente do guia do utilizador do seu instrumento de sequenciação Illumina.

Referência:

1. Gupta N, Marquez S, Soto C, et al. Sequenciação em massa de mRNA com códigos de barras moleculares para avaliação do isótipo de células B e evolução clonal: um método da comunidade AIRR[M]//Imunogenética. Humana, Nova Iorque, NY, 2022: 345-377.