Sequenciação do Exoma Total Baseada em Protocolo de Captura por Hibridização

Purificação

1. Deixe as esferas AMPure XP atingirem a temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos.
2. Misture bem o reagente num misturador vortex até que apareça homogéneo. Adicione 180 μl de esferas AMPure XP homogéneas a um tubo LoBind de 1,5 ml e adicione a biblioteca de DNA fragmentada (~120 μl).
3. Misture bem num misturador de vórtice e incube durante 5 minutos à temperatura ambiente.
4. Coloque o tubo num suporte magnético e aguarde que a solução fique clara (3–5 min).
5. Mantenha o tubo no suporte magnético. Descarte a solução clarificada do tubo sem perturbar as esferas.
6. Continue a manter o tubo no suporte magnético enquanto dispensa 500 μl de etanol a 70% em cada tubo.
7. Deixe o tubo descansar durante 1 minuto para permitir que as esferas perturbadas se assentem e, em seguida, remova o etanol. Repita este passo uma vez.
8. Seque as amostras em um bloco de aquecimento a 37°C durante 5 minutos ou até que o etanol residual evapore completamente.
Adicione 30 μl de água livre de nuclease, misture bem num misturador vortex e incube durante 2 minutos à temperatura ambiente.
10. Coloque o tubo no suporte magnético e deixe por 2–3 minutos ou até a solução ficar clara.
11. Remova aproximadamente 30 μl do sobrenadante para um tubo LoBind novo de 1,5 ml.

Avaliar Qualidade

1. Utilize o chip Agilent DNA 1000 e o kit de reagentes para preparar o chip com amostras e escada.
2. Coloque o chip no Bioanalisador 2100 e inicie a corrida dentro de 5 minutos após a preparação.
3. Verifique se o eletroferograma mostra uma distribuição com um tamanho de pico de ~190 nucleotídeos.

Reparação de Fim

1. Prepare a mistura de reação em gelo. Misture bem num misturador de vórtice. Adicione 71 μl da mistura de reação e 29 μl da amostra de DNA a cada tubo. Misture por pipetagem.
2. Incubar o tubo num termociclador durante 30 minutos a 20°C. Não utilizar tampa aquecida.
3. Purifique a amostra utilizando 90 μl de esferas AMPure XP homogéneas, seguindo as instruções. Elua em 32 μl de água isenta de nucleases.

A-Tailing

1. Prepare a mistura de reação. Adicione 32 μl de cada amostra de DNA a cada poço ou tubo. Misture pipetando.
2. Incubar num termociclador durante 30 min a 37°C, com a temperatura da tampa a não exceder 50°C.
3. Purifique a amostra utilizando 90 μl de esferas AMPure XP homogéneas, seguindo as instruções, e eluia em 15 μl de água livre de nucleases.
4. Prossiga imediatamente para a etapa de ligadura do adaptador.

Ligação de Adaptador

1. Anelhe os adaptadores.
2. Prepare a mistura de reação.
3. Adicione 36 μl da mistura de reação e 14 μl da amostra de DNA a cada tubo. Misture por pipetagem.
4. Incubar durante 15 min a 20°C num termociclador. Não utilizar uma tampa aquecida.
5. Purifique a amostra utilizando 90 μl de esferas AMPure XP homogéneas, seguindo as instruções. Elua em 52 μl de água livre de nucleases.

Amplificação Pré-hibridização

1. Utilize metade dos fragmentos ligados ao adaptador para amplificação e guarde a outra metade a 20°C para uso futuro, se necessário.
2. Prepare a mistura de reação (25 μl) conforme indicado na Tabela 5 e adicione 25 μl de cada amostra de DNA a cada tubo.
3. Misture por pipetagem e execute o programa.
4. Purifique a amostra utilizando 90 μl de esferas AMPure XP homogéneas e elua em 30 μl de água livre de nucleases.

Avaliar Qualidade e Quantidade

1. Utilize o chip Agilent DNA 1000 e o kit de reagentes para preparar o chip com amostras e escada.
2. Carregue o chip no Bioanalisador 2100 e inicie a corrida dentro de 5 minutos após a preparação.
3. Após a corrida, determine a concentração da amostra através da integração sob o pico.
4. Verifique se o eletroferograma apresenta uma distribuição com um tamanho de pico de 250 ± 10% pb.

Hibridação

Concentre uma alíquota de 500 ng da biblioteca a 3,4 μl utilizando um concentrador a vácuo a ≤45°C.
2. Misture os componentes para preparar a mistura em bloco num tubo de PCR.
Adicione 3,4 μl de biblioteca preparada a 147 ng/μl com 5,6 μl de SureSelect Block Mix (Tubo A).
4. Misture os componentes na Tabela 8 à temperatura ambiente para preparar o tampão de hibridização (Tubo B).
5. Dilua 1 μl de RNase Block com 2 μl de água livre de nucleases.
6. Numa tubo separado, misture 5 μl da biblioteca de captura SureSelect com 2 μl de RNase Block diluído (Tubo C).
7. Coloque o tubo "A" no termociclador com o seguinte programa.
8. Utilize uma tampa aquecida no ciclista térmico a 105°C durante todo o processo.
9. Mantenha o ciclista a 65°C enquanto adiciona 40 μl de tampão de hibridação (Tubo B).
Incubar ambos os tubos durante um mínimo de 5 minutos a 65°C.
11. Coloque a mistura da biblioteca de captura (Tubo C) no ciclista.
12. Incube as amostras a 65°C durante 2 minutos.
13. Mantenha o ciclista a 65°C enquanto utiliza uma pipeta para retirar 13 μl de Buffer de Hibridização do tubo "B" e adicioná-lo ao tubo da mistura da biblioteca de captura SureSelect "C."
14. Mantenha o ciclista a 65°C e transfira todo o conteúdo da mistura de biblioteca preparada no tubo "A" para a solução de hibridação no tubo "C."
15. Feche cuidadosamente o tubo "C" e incube a mistura de hibridização durante 24 horas a 65°C com uma tampa aquecida.

Preparação de Esferas Magnéticas

1. Mantenha o Tampão de Lavagem SureSelect #2 a 65°C em banho-maria.
2. Deixe as esferas Dynal MyOne Streptavidin T1 (Invitrogen) atingirem a temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos.
3. Ressuspenda vigorosamente num misturador vortex e transfere 50 μl de esferas magnéticas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. Lave as contas:
(a) Adicione 200 μl de tampão de ligação SureSelect.
(b) Misture as contas num misturador de vórtice durante 5 s.
(c) Coloque o tubo num suporte magnético e aguarde até a solução ficar clara (3–5 min).
(d) Remova cuidadosamente e descarte o sobrenadante.
(e) Repita os passos (a a d) para um total de três lavagens.
5. Ressuspenda as esferas em 200 μl de tampão de ligação SureSelect.

Seleção de Captura Híbrida

1. Estime e registe o volume de hibridação que permaneceu após 24 horas de incubação.
2. Adicione a mistura de hibridização diretamente da termocicladora à solução de esferas e misture invertendo de três a cinco vezes.
3. Incubar a solução de captura híbrida/balas num Nutator ou equivalente durante 30 minutos à temperatura ambiente.
4. Certifique-se de que o conteúdo está a misturar-se corretamente.
5. Gire brevemente numa centrífuga e separe as esferas e o tampão num separador magnético.
6. Mantenha o tubo no suporte magnético durante 3–5 minutos.
7. Descarte a solução limpa do tubo sem perturbar as esferas.
8. Resuspenda as esferas em 500 μl de SureSelect Wash Buffer #1 misturando num misturador vortex durante 5 s.
9. Incubar as amostras durante 15 minutos à temperatura ambiente. Misturar ocasionalmente num misturador vortex.
10. Gire brevemente em uma centrífuga, separe as esferas e o tampão em um separador magnético e remova o sobrenadante.
11. Lave as contas:
(a) Resuspenda as esferas em 500 μl de Buffer de Lavagem SureSelect #2 pré-aquecido a 65°C e misture num misturador vortex durante 5 s para resuspender as esferas.
(b) Incubar as amostras durante 10 min a 65°C num bloco de aquecimento ou equivalente. Misturar ocasionalmente num misturador vortex.
(c) Brevemente girar numa centrífuga.
(d) Separe as contas e o tampão num separador magnético Dynal e remova o sobrenadante.
(e) Repita os passos (a a d) para um total de três lavagens. Remova todos os vestígios do tampão de lavagem antes de prosseguir para o passo 12.
Misture as pérolas em 50 μl de Buffer de Eluição SureSelect num misturador vortex durante 5 s para ressuspender as pérolas.
13. Incubar as amostras durante 10 minutos à temperatura ambiente. Misturar ocasionalmente num misturador vortex.
14. Gire brevemente numa centrífuga e separe as esferas e o tampão num suporte magnético.
15. Transfira o sobrenadante (DNA capturado) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
Adicione 50 μl de Tampão de Neutralização SureSelect ao DNA capturado e misture brevemente.
17. Purifique a amostra utilizando 180 μl de esferas AMPure XP homogéneas, seguindo as instruções, e elua em 30 μl de água livre de nucleases.

Amplificação pós-hibridização

1. Prepare a mistura de reação em gelo. Misture bem num misturador vortex.
Adicione 15 μl da amostra de DNA a 35 μl da mistura de reação.
3. Misture por pipetagem, coloque o tubo num ciclista térmico e execute o programa.
4. Purifique a amostra utilizando 90 μl de esferas AMPure XP homogéneas e elua em 30 μl de água livre de nucleases, seguindo as instruções.
5. Avaliar qualidade e quantidade.
6. Determine a concentração da amostra através da integração sob o pico.
7. O eletroferograma deve mostrar um pico na faixa de tamanho de aproximadamente 300–400 nucleotídeos.
8. Realize quantificação adicional por PCR em tempo real.

Geração de Clusters

1. Dilua e desnature as bibliotecas a 8 pM (∼1,6 pg/µl de DNA de 300 bp) utilizando NaOH 0,1 N.
2. Descongele e prepare os reagentes seguindo as instruções do Kit de Geração de Clusters da Illumina.
3. Abra e execute a receita apropriada na estação de cluster.
4. Siga as instruções da receita para carregar a célula de fluxo.
5. Siga as instruções da receita para carregar os reagentes.
6. Complete os passos de geração de clusters: hibridização, amplificação, linearização, bloqueio e hibridização de primers.
7. Pegue a célula de fluxo para sequenciação.

Sequenciação

1. Realize um passo de lavagem pré-corrida no sequenciador.
2. Descongele e prepare o reagente de sequenciação seguindo as instruções do Kit de Sequenciação.
3. Carregar o reagente de sequenciação.
4. Posições principais no analisador de genoma.
5. Limpar e instalar o prisma e a célula de fluxo.
6. Verifique a entrega adequada do reagente e aplique óleo.
7. Realize a incorporação da primeira base da leitura 1 e a auto-calibração.
8. Verificar métricas de qualidade.
9. Continue a corrida pelo número desejado de ciclos.

Referência:

1. Priya R R, Rajasimha H K, Brooks M J, et al. Sequenciação do exoma: captura e sequenciação de todas as regiões codificantes humanas para a descoberta de genes de doenças. Desenvolvimento Retinal: Métodos e Protocolos, 2012: 335-351.