Protocolo de Sequenciação do Transcritoma de Infecção Viral

Infeção de Células

1. Semear células CRFK em 75 cm² frascos e incubar a 37 °C com 5 % de CO₂ até as células atingirem 60–70 % de confluência.
2. Remova o meio e lave as células com D-PBS.
3. Infectar os frascos com o vírus a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 2 em 2 ml, ou 2 ml de D-PBS como controlo simulado, e incubar a 37 °C com 5 % de CO.₂ por 1 h para permitir a adesão. Realizar inoculações em duplicado, uma para extração de RNA e a outra para visualização de CPE.
4. Adicione 10 ml de meio de manutenção com 10 % de FBS e incube os frascos durante 3 horas.
5. Após 3 horas de incubação, remova o inóculo e lave as células com D-PBS.
6. Adicione 2 ml de TrypLE e incube por 1–2 minutos até as células se descolarem.
7. Transfira as células para um tubo de centrífuga e pellete as células por centrifugação a 120 × g durante 5 min e descarte o sobrenadante.
8. Adicione 10 ml de D-PBS e repita a centrifugação para remover todos os vestígios de meio e TrypLE, que podem reduzir o rendimento de RNA.
9. Descarte os sobrenadantes e armazene os pellets celulares a −80 °C até a purificação do RNA.

Purificação de RNA a partir de Células Infectadas

O kit RNeasy foi utilizado para extrair e purificar amostras de RNA neste estudo, mas outros protocolos de extração de RNA também podem ser adequados.
1. Pulverize todas as micropipetas, luvas, área de trabalho e outras coisas com RNase AWAY para remover qualquer contaminação por RNase e DNA.
2. Extraia RNA utilizando o kit RNeasy de acordo com as instruções do fabricante.
3. Alíquotar os RNAs eluídos (500 μl) em três tubos diferentes para evitar o descongelamento e congelamento repetido da amostra, o que poderia afetar a qualidade do RNA.
4. Utilize dois tubos para análise de controlo de qualidade com espectrofotómetro e bioanalisador Illumina Agilent 2100 e armazene o terceiro a −80 °C para sequenciação.

Análise da Qualidade do RNA Total

1. Determine a qualidade do RNA extraído medindo a absorbância a 260 e 280 nm em espectrofotómetro UV/Visível.
2. Considere as amostras com o valor da razão de absorbância (A260/A280) de 1,8 a 2,0 para análise adicional com o Bio-analisador Illumina Agilent 2100 para determinar tanto a qualidade como a quantidade de RNA.
3. Para garantir que as amostras são da mais alta qualidade e quantidade para sequenciação do transcriptoma, realize uma análise de qualidade e quantidade das amostras de RNA total extraídas.
4. Carregue e prepare as misturas de gel e corante, em seguida, carregue o marcador, a escada e as amostras da maneira especificada.
5. Vortexe o chip e insira-o. Analise os chips com base no método recomendado pelo fabricante. Verifique se a corrida foi bem-sucedida e se a amostra está devidamente preparada e manuseada, garantindo que foi pipetada corretamente nos poços.

Preparação de Amostras para Sequenciação de Pares de Extremidade

Realize os seguintes passos utilizando os reagentes fornecidos no kit de preparação de amostras de extremidade pareada, de acordo com as instruções do fabricante.
1. Fragmentar o DNA genómico em fragmentos com menos de 800 pb.
2. Realizar a reparação das extremidades de fragmentos de DNA para gerar extremidades rombas com fosfato a 5'.
3. Adicione uma base "A" às extremidades 3' para criar uma saliência 3'-dA.
4. Ligue adaptadores às extremidades dos fragmentos de DNA.
5. Purifique os produtos de ligadura removendo os adaptadores não ligadas.
6. Enriquecer os Fragmentos de DNA Modificados por Adaptador através de PCR.
7. Obter a biblioteca de DNA genómico.