Sequenciação do Receptor de Células T Usando o Protocolo RNA-Seq

Isolamento de RNA e Avaliação da Qualidade

1. Garantir uma configuração correta da estação de preparação do chip.
2. Os seguintes componentes do kit devem ser preparados antes da primeira utilização de acordo com as instruções do fabricante:
(a) Alíquotas de escada de RNA, estáveis a -70 °C por períodos prolongados.
(b) Alíquotas da matriz de gel Agilent RNA 6000 Nano (65 μl) podem ser armazenadas a 4 °C durante 1 mês (proteger da luz durante o uso).
3. Para preparar a matriz de gel-corante, deixe um alíquota da matriz de gel Agilent RNA 6000 Nano (65 μl) e o concentrado de corante RNA 6000 Nano atingirem a temperatura ambiente durante 30 minutos.
4. Vortexe os concentrados de corante durante 10 s e centrifugue.
Pipetar 1 μl de concentrado de corante para 65 μl de matriz de gel (uma alíquota) num tubo de microcentrífuga.
6. Vortexar bem e verificar a mistura adequada do gel e do corante.
7. Centrifugar à temperatura ambiente durante 10 min a 13.000 ×g, proteger da luz e utilizar dentro de 1 dia. Armazenar a 4 °C se não for utilizado imediatamente.
8. Para carregar a matriz de gel-corante, verifique a configuração adequada da estação de preparação do chip e coloque um chip RNA 6000 Nano não utilizado na estação de preparação do chip.
Pipete 9,0 μl da mistura de gel e corante para o fundo do poço "G" com fundo preto.
10. Posicione o êmbolo da seringa na estação de priming do chip para 1 ml; em seguida, feche a estação de priming do chip e pressurize rapidamente pressionando para baixo o êmbolo. Mantenha por exatamente 30 s.
11. Libere o êmbolo e puxe suavemente até a marca de 1 ml.
12. Abra a estação de preparação do chip e pipete 9,0 μl da matriz de gel-corante para o fundo dos dois poços marcados com "G" sem fundo.
13. Para carregar a escada e a amostra no chip, pipete 5 μl de marcador de RNA para todos os poços de amostra e o poço que está marcado com o símbolo da escada.
14. Adicione 1 μl de marcador ao poço que está assinalado com o símbolo do marcador.
15. Adicione 1 μl de RNA de interesse a todos os poços da amostra. Se houver menos de 12 amostras para medir, coloque 1 μl de marcador de RNA nos poços que não são utilizados.
16. Vortexe o chip horizontalmente no vortex IKA (1 min, 2400 rpm) e insira na estação Bioanalyzer 2100 dentro de 5 min para realizar a análise utilizando o software 2100 Expert.

Preparação da Biblioteca

Purificação e Fragmentação de mRNA

Traga 0,1–1,0 μg de RNA total para um volume de 50 μl utilizando água ultrapura livre de nucleases e transfira para os poços individuais da placa de beads de RNA.
2. Esferas de purificação de RNA Vortex e transferir 50 μl para cada poço.
3. Selar a placa com Microseal "B" e agitar a placa (1 min, 1000 rpm).
4. Aqueça o prato no sistema de microaquecimento (5 min, 65 °C, tampa fechada) e arrefeça em gelo (1 min).
5. Incubar a placa à temperatura ambiente (5 min). Entretanto, aquecer o sistema de microaquecimento a 80 °C.
6. Para a descida magnética, remova o selo e coloque a placa no suporte magnético. Inspecione visualmente até que o líquido esteja claro.
7. Remova o sobrenadante de todos os poços. Em seguida, retire a placa do suporte.
8. Pipete 200 μl de Buffer de Lavagem de Esferas em todos os poços; feche a placa e misture agitando (1 min, 1000 rpm).
9. Repita os passos 6 e 7.
10. Pipetar 50 μl de Tampão de Eluição em todos os poços; selar a placa e misturar agitando (1 min, 1000 rpm).
11. Aqueça o prato no sistema de microaquecimento (2 min, 80 °C, tampa fechada) e arrefeça em gelo (1 min).
12. Coloque o prato na bancada e remova o selo.
13. Para preparar a fragmentação do RNA, pipete 50 μl de Buffer de Ligação de Esferas em todos os poços; feche a placa e misture agitando (1 min, 1000 rpm).
14. Incubar o prato à temperatura ambiente (5 min).
15. Repita os passos 6–9 (atração magnética, lavagem das esferas, outra atração magnética).
16. Pipet 19,5 μl de Fragmento, Mistura de Prime e Finish em todos os poços, feche a placa e misture agitando (1 min, 1000 rpm).
17. Remova o selo e transfira as amostras bem a bem para a placa de fragmentação de RNA.
18. Selar a placa e executar o seguinte programa no termociclador com a tampa pré-aquecida:
(a) 94 °C durante 8 min
(b) Manter a 4 °C.
19. Gire rapidamente para baixo.

Síntese de cDNA da Primeira Cadeia

Fragmentos de RNA purificados são transcritos reversamente para cDNA de primeira cadeia usando primers hexâmeros aleatórios.
1. Para a atração magnética, coloque a placa no suporte magnético. Inspecione visualmente até que o líquido esteja claro.
2. Remova o selo e transfira 17 μl de sobrenadante, bem a bem, para a placa de cDNA.
3. Centrifugar a mistura Act D da síntese da primeira cadeia (5 s, 600 ×g).
4. Misture a transcriptase reversa SuperScript II e o Mix Act D de Síntese da Primeira Cadeia numa proporção de 1:10 (1 μl de transcriptase reversa SuperScript II mais 9 μl do Mix Act D de Síntese da Primeira Cadeia (pode ser armazenado por períodos prolongados a -20 °C).
5. Pipete 8 μl desta mistura em cada poço da placa de cDNA e misture agitando (20 s, 1600 rpm).
6. Centrifugar (1 min, 280 ×g).
7. Execute o seguinte programa no termociclador com a tampa pré-aquecida a 100 °C:
(a) 25 °C durante 10 min.
(b) 42 °C durante 15 min.
(c) 70 °C durante 15 min.
(d) Manter a 4 °C.

Síntese de cDNA da Segunda Cadeia

Adicione 5 μl de tampão de ressuspensão a cada poço.
2. Centrifugar a Mistura de Marcação da Segunda Cadeia (5 s, 600 ×g) e pipetar 20 μl para cada poço, misturando por agitação (20 s, 1600 rpm).
3. Centrifugar a placa (1 min, 280 ×g).
4. Coloque a placa no termociclador com a tampa pré-aquecida a 30 °C e execute a 16 °C durante 60 minutos. Deixe arrefecer até à temperatura ambiente depois.
5. Pipete 90 μl de esferas AMPure XP para uma nova placa de purificação de cDNA e transfira o conteúdo da placa de cDNA bem a bem para a placa de purificação de cDNA. Misture agitando (2 min, 1800 rpm).
6. Incubar à temperatura ambiente (15 min) e depois centrifugar (1 min, 280 ×g).
7. Coloque o prato no suporte magnético. Inspecione visualmente até que o líquido esteja claro. Remova 135 μl de sobrenadante de cada poço.
8. Lave as esferas com o prato retido no suporte magnético, adicionando 200 μl de etanol a 80% a todos os poços. Após 30 s, remova todo o sobrenadante de cada poço.
9. Repita o passo 8 e remova cuidadosamente todo o etanol restante (usando uma pipeta de pequeno volume). Deixe as amostras secar ao ar no suporte magnético (15 min).
10. Remova a placa do suporte e adicione 17,5 μl de tampão de ressuspensão a todos os poços. Misture agitando (2 min, 1800 rpm). Deixe repousar à temperatura ambiente (2 min).
11. Centrifugar (1 min, 280 ×g).
12. Coloque o prato no suporte magnético. Inspecione visualmente até que o líquido esteja claro. Transfira 15 μl de sobrenadante para o novo prato (prato de ligação de adaptadores). Este é o primeiro ponto de paragem seguro, onde o prato selado pode ser armazenado a -20 °C durante 1 semana.

Adenilação da extremidade 3' e Ligação de Adaptadores

Adicione 2,5 μl de tampão de ressuspensão a todos os poços da placa de ligação do adaptador e centrifugue (5 s, 600 ×g).
2. Pipete 12,5 μl de A-Tailing Mix em cada poço e misture agitando (2 min, 1800 rpm).
3. Coloque a tampa com Microseal "B" e centrifugue (1 min, 280 ×g).
4. Incubar em sistema de microaquecimento a 37 °C (30 min), depois transferir para sistema de microaquecimento a 70 °C (5 min, tampa fechada) e arrefecer em gelo (1 min).
5. Centrifugar a placa de índices TruSeq RNA CD (1 min, 280 ×g).
6. Transferir para todos os poços das placas de ligação do adaptador nesta ordem:
(a) 2,5 μl de tampão de ressuspensão
(b) 2,5 μl Mistura de Ligation
(c) 2,5 μl de adaptadores de RNA da placa de adaptadores de índice (para cada poço correspondente). E misture agitando (2 min, 1800 rpm).
7. Centrifugar (1 min, 280 ×g) a placa e transferir para o sistema de microaquecimento (10 min, 30 °C, tampa fechada) e, em seguida, arrefecer em gelo.
8. Centrifugue o Buffer de Paragem de Ligação (5 s, 600 ×g) e adicione 5 μl a cada poço. Misture agitando (2 min, 1800 rpm).
9. Centrifugar a placa (1 min, 280 ×g).
Adicione 42 μl de esferas AMPure XP a cada poço. Misture agitando (2 min, 1800 rpm).
11. Incubar à temperatura ambiente (15 min) e, em seguida, centrifugar a placa (1 min, 280 ×g).
12. Coloque o prato no suporte magnético. Inspecione visualmente até que o líquido esteja claro (aprox. 5 min). Remova todo o sobrenadante.
13. Lave as pérolas com o prato mantido no suporte magnético, adicionando 200 μl de etanol a 80% a todos os poços. Após 30 segundos, remova o etanol.
14. Repita o passo 13 e remova cuidadosamente todo o etanol restante (usando uma pipeta de baixo volume). Deixe as amostras secar ao ar no suporte magnético (15 min).
15. Remova a placa de suporte e pipete 52,5 μl de tampão de ressuspensão em cada poço, e misture agitando (2 min, 1800 rpm).
16. Incubar à temperatura ambiente (2 min).
17. Centrifugue a placa (1 min, 280 ×g) e coloque-a no suporte magnético. Inspecione visualmente até que o líquido esteja claro.
18. Transferir 50 μl de sobrenadante bem a bem para uma nova placa.
19. Repita os passos 10–17, mas use 50 μl de esferas AMPure XP no passo 10 e 22,5 μl de tampão de ressuspensão no passo 15.
20. Transfira 20 μl de sobrenadante bem a bem para uma nova placa. A placa selada pode ser mantida a -20 °C durante 1 semana (este é o segundo ponto de paragem seguro).

Enriquecimento de Fragmentos de DNA

1. Em gelo, pipetar 5 μl de Cocktail de Primers de PCR e 25 μl de Master Mix de PCR em cada poço, misturar agitando (20 s, 1600 rpm) e centrifugar (1 min, 280 ×g).
2. Transferir para o termociclador com a tampa pré-aquecida a 100 °C e executar.
3. Centrifugar a placa (1 min, 280 ×g) e pipetar 47,5 μl de beads AMPure XP em cada poço. Misturar agitando (2 min, 1800 rpm).
4. Incubar à temperatura ambiente (15 min) e depois centrifugar (1 min, 280 ×g).
5. Coloque o prato no suporte magnético. Inspecione visualmente até que o líquido esteja claro. Remova todo o sobrenadante.
6. Lave as esferas com o prato mantido no suporte magnético, adicionando 200 μl de etanol a 80% a todos os poços. Após 30 s, remova o etanol.
7. Repita o passo 6 do Subtítulo 3.2.5 e remova cuidadosamente todo o etanol restante (usando uma pipeta de baixo volume). Deixe as amostras secar ao ar em um suporte magnético (15 min).
8. Ressuspenda as esferas em 32,5 μl de tampão de ressuspensão. Misture agitando (2 min, 1800 rpm).
9. Incubar à temperatura ambiente (2 min) e, em seguida, centrifugar (1 min, 280 ×g).
10. Coloque a placa no suporte magnético. Inspecione visualmente até que o líquido esteja claro e transfira 30 μl de sobrenadante para uma nova placa. As bibliotecas podem ser mantidas a -20 °C durante 1 semana (este é o terceiro ponto seguro de paragem).

Sequenciação

A sequenciação das bibliotecas é realizada num sistema de sequenciação Illumina. Existem várias configurações que proporcionam uma saída alvo de 30 milhões de leituras por amostra (por exemplo, sistemas Illumina NextSeq 550, 1000 e 2000 e NovaSeq 6000). Dependendo do sistema de sequenciação selecionado, do fluxo celular e do comprimento da leitura, podem ser multiplexadas entre 4 e 132 amostras (máximo: dois fluxos celulares S4 no NovaSeq 6000 com sequenciação de 2x100 bp) numa única corrida de sequenciação.