Protocolo de Sequenciação de Amplicões Alvo por PCR Multiplex para Genotipagem de SNPs

PCR Multiplex

1. Prepare a mistura de primers adicionando todos os primers diretos e reversos. Na solução resultante, cada primer deve ter uma concentração final de 1 μM.
2. Prepare a mistura mestre multiplex adicionando todos os reagentes, exceto o template de DNA. Prepare uma quantidade suficiente de mistura mestre para todas as amostras e controles PCR.
3. Distribua 16 μl da mistura mestre em tiras/placas de PCR e feche todas as tampas.
4. Para evitar contaminação cruzada, adicione 4 μl do template de DNA a cada tubo de reação individualmente (abra apenas um tubo ou uma fila de tubos de cada vez).
5. Após a configuração da PCR, coloque os tubos/tiras/placa em um termociclador fora do laboratório de DNA antigo e inicie a amplificação: passo inicial a 95 °C por 10 min para ativar a polimerase de hot-start, seguido por 30 ciclos de desnaturação por 10 s a 94 °C, anelamento de primers por 30 s à temperatura de anelamento requerida, e elongação por 30 s a 72 °C. O protocolo termina com um passo final de extensão a 72 °C por 4 min.
6. Após a amplificação estar concluída, dilua as reações 1:10–1:100 com água de grau HPLC. Este será o template para a PCR de indexação.

PCR de Indexação

1. Prepare a mistura mestre adicionando todos os reagentes, exceto os produtos de PCR multiplex diluídos e os primers de indexação com código de barras. Prepare uma quantidade suficiente de mistura mestre para todas as amostras e controles PCR.
2. Distribua 7 μl da mistura mestre em tiras/placas de PCR e feche todas as tampas.
3. Adicione 2 μl de cada primer de código de barras individual a cada tubo de reação.
4. Adicione 1 μl do produto de PCR diluído (do passo 1) a cada tubo de reação individualmente.
5. Após a configuração da PCR, execute a PCR de indexação em um termociclador: passo inicial a 95 °C por 10 min para ativar a polimerase de hot-start, seguido por 10 ciclos de desnaturação por 15 s a 95 °C, anelamento de primers por 30 s a 60 °C, e elongação por 60 s a 72 °C. O protocolo termina com um passo final de extensão a 72 °C por 4 min.

Purificação e Quantificação da Biblioteca

1. Prepare a mistura mestre adicionando todos os reagentes, exceto os produtos de PCR multiplex diluídos e os primers de indexação com código de barras. Prepare uma quantidade suficiente de mistura mestre para todas as amostras e controles PCR.
2. Purifique as reações em uma placa magnética de 96 poços usando as esferas de reagente Agencourt AMPure XP de acordo com as instruções do fabricante. Elua e armazene o DNA em 20 μl de água de grau HPLC.
3. Quantifique as bibliotecas de amplicons purificados com o ensaio de quantificação Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA de acordo com as instruções do fabricante.
4. Junte todas as bibliotecas de amostras usando uma quantidade igual de DNA.

Sequenciamento

1. Meça a concentração de DNA da biblioteca agrupada em um fluorômetro Qubit de acordo com as instruções do fabricante e dilua para a concentração requerida.
2. Sequencie as bibliotecas de amplicons purificadas e agrupadas em sequenciadores Illumina usando CS1, CS2 e seus complementos reversos como primers de sequenciamento de acordo com as instruções do fabricante.

Referência:

1. Wutke S, Ludwig A. Amplificação PCR direcionada e sequenciamento multiplex de DNA antigo para análise de SNP[J]. DNA Antigo: Métodos e Protocolos, 2019: 141-147.