Preparação de Biblioteca de RNA Pequeno para Protocolo de Sequenciação de Nova Geração

Isolamento de RNA

1. Homogeneizar amostras de tecido: Triturar 100 mg de tecido em azoto líquido até obter um pó fino. Misturar 1 mL de solução de TRI Reagent® com o pó num tubo de microcentrífuga.
2. Alternativamente, homogeneize células cultivadas ou fluidos corporais: Homogeneize e lise as células diretamente adicionando 1 mL de solução de TRI Reagent® por 5–10 × 10^6 células ou por cada 10 cm² de área de placa de cultura e pipete para cima e para baixo.
3. Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente para permitir a dissociação completa dos complexos nucleoproteicos.
4. Adicione 200 μL de cloroforme e misture vigorosamente durante 15 s. Incube à temperatura ambiente por mais 5 min.
5. Centrifugue a amostra a 16.000 × g a 4 °C durante 15 min. A amostra deve separar-se em uma fase aquosa clara na parte superior, uma fase interfacial branca no meio e uma fase orgânica rosa na base do tubo. Transfira a fase aquosa superior para um tubo de microcentrífuga novo, tendo cuidado para não levar nenhuma parte da fase interfacial ou da fase orgânica. Anote o volume da fase aquosa transferida.
6. Adicione 1 volume de isopropanol ao extrato aquoso de RNA e misture bem. Isto pode ser incubado à temperatura ambiente durante 10 minutos ou a -80 °C durante 30 minutos. O tempo e a temperatura de coprecipitação podem variar com diferentes amostras e podem exigir otimização para o organismo ou tipo de tecido em questão.
7. Centrifugue a amostra a 10.000 × g a 4 °C durante 10 min e remova o sobrenadante. Um pellet branco deve ter se formado na base do tubo—este é o RNA.
8. Lave o pellet com 1 mL de etanol a 80%. Vortexe para soltar o pellet e centrifugue a 7500 × g durante 5 minutos a 4 °C. Repita este passo uma vez.
9. Remova o etanol residual e deixe o pellet de RNA a secar ao ar durante 5–10 min, mantendo o tubo aberto. Ressuspenda o RNA no volume desejado de água livre de nucleases e armazene a -80 °C. Se tiver dificuldade em dissolver o RNA, a água e a amostra de RNA podem ser aquecidas a 70 °C durante 5 min.
10. Quantifique a concentração de RNA utilizando um NanoDrop.

Purificação de sRNA

1. Misture o eluído de RNA com três volumes de etanol absoluto, 0,1 volume de acetato de sódio (pH 5,0) e 1 μL de glicogénio (5 mg/mL); e armazene a -20 °C ou -80 °C durante a noite. Centrifugue as amostras a 20.000 × g durante 20 min a 4 °C, lave o pellet de RNA duas vezes com etanol a 80%, deixe o RNA secar ao ar durante 5 min e ressuspenda-o em um volume apropriado de água livre de nucleases. Determine a concentração de RNA usando um NanoDrop.

Adenilação do Adaptador HD 3'

A adenilação do adaptador HD 3' deve ser realizada de acordo com as instruções do fabricante para o Kit de Adenilação de DNA 5'.
2. Incubar a reação a 65 °C durante 1 h.
3. Incubar a mistura de reação a 85 °C durante 5 minutos para inativar a ligase de RNA Mth e, em seguida, arrefecer em gelo.
4. Limpe o adaptador adenilado utilizando o Zymo Oligo Clean and Concentrator, seguindo as instruções do fabricante.
5. Determine a concentração do adaptador adenilado por Nanodrop e ajuste-a para uma concentração final de 10 μM. O peso molecular do adaptador HD 3' é 8015 g/mol.
6. Execute o adaptador adenilado e o adaptador não adenilado no mesmo gel de poliacrilamida a 15% com uréia. Para preparar um gel de poliacrilamida a 15 mL com uréia, primeiro prepare uma solução de 5 mL com 3,5 mL de água livre de nucleases e 1,5 mL de TBE 5× num tubo Falcon de 50 mL.
tubo. Pese 6,3 g de ureia e dissolva na solução de água/TBE a 37–42 °C. Não é aconselhável aquecer a mistura no micro-ondas, pois o tubo Falcon pode explodir. Adicione 5,5 mL de solução de acrilamida/bis a 40% (19:1), seguido de 7,5 μL de N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED) e 150 μL de persulfato de amónio (APS) a 10%. Ajuste o volume final para 15 mL com água livre de nucleases. O adaptador adenilado pode ser armazenado a -80 °C.

Ligadura de Adaptador HD 3'

1. Descongele 50% de PEG 8000 num bloco de aquecimento a 37 °C e depois mantenha à temperatura ambiente pelo restante do protocolo.
2. Configure os blocos de aquecimento a 26 °C e 70 °C.
Misture 11,25 μL da amostra de RNA com 1 μL de adaptador 3' HD pré-adenilado a 10 μM.
4. Desnaturar a mistura de RNA e adaptadores a 70 °C durante 2 minutos e depois arrefecer em gelo.
5. Adicione a seguinte mistura de reação de ligadura à mistura de RNA desnaturado e adaptadores.
6. Incubar a mistura de reação a 26 °C durante 2 h.
7. Limpe a reação de ligação da extremidade 3' utilizando o Zymo RNA Clean and Concentrator, seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. Na fase final da limpeza do kit, eluia o RNA em 12,1 μL de água livre de nucleases e mantenha-o em gelo.

Remoção do Adaptador HD 3' em Excesso

Desadenilar o adaptador 3' HD restante utilizando a deadenilase da NEB.
2. Incubar a mistura de reação acima a 30 °C durante 30 min.
3. Pare a reação adicionando 4 μL de EDTA a 25 mM e coloque o tubo no gelo imediatamente.
4. Adicione 2 μL de Tris–HCl 0,5 M (pH 9,0), 7 μL de MgCl 50 mM.₂e 1 μL de Exonuclease RecJ no tubo. Misture bem.
5. Incubar a reação de exonuclease a 37 °C durante 30 min.

Ligações do Adaptador 5' HD

Desnaturar 1 μL de adaptador HD 5' a 20 μM a 70 °C durante 2 minutos e arrefecer em gelo.
2. Adicione o adaptador 5' HD desnaturado à mistura da reação de exonuclease.
3. Adicione os reagentes no tubo sequencialmente e misture por pipetagem.
4. Incubar a reação de ligação 5' a 26 °C durante 2 h.
5. Limpe a reação de ligadura de 5' utilizando o Kit de Limpeza e Concentração de RNA, seguindo as instruções do fabricante; no último passo, elua a mistura de ligadura em 30 μL de água livre de nucleases e coloque a reação em gelo.

Síntese e Amplificação de cDNA

1. Prepare a reação de síntese de cDNA a seguir e misture bem. Incube a 37 °C durante 20 minutos.
2. Inative a reação incubando por 15 minutos a 85 °C e depois arrefeça em gelo. O cDNA gerado nesta etapa pode ser armazenado a -20 °C ou -80 °C indefinidamente.
3. Prepare a mistura de reação de PCR seguinte para amplificar a biblioteca de cDNA.
4. Realize a reação de PCR nas seguintes condições. Os produtos finais podem ser armazenados a -20 °C indefinidamente.

Eletroforese em Gel e Extração de Produtos de PCR

1. Execute os produtos de PCR em um gel de poliacrilamida nativa a 8% e carregue uma escada de DNA de 20 bp para determinação de tamanho. Utilizámos o sistema Mini-PROTEAN III para a eletroforese.
2. Execute o gel a 120 V durante 1,5–2 h em 0,5× TBE.
3. Mancha o gel com SYBR® Gold e visualiza num scanner ou caixa UV.
4. Corte as bandas de ADN em torno de 145–150 bp com uma lâmina estéril — isto contém a biblioteca de cDNA de sRNAs.
5. Coloque o gel num "tubo de quebra de gel" e centrifugue a 20.000 × g durante 5 minutos. Fazemos estes tubos perfurando a base de um tubo Eppendorf de 0,5 mL com uma agulha BD Microlance 3 de 0,8 mm × 16 mm.
6. Eluir a biblioteca de cDNA em tampão de enzima de restrição NEB 1× agitando a suspensão de gel durante a noite a 4 °C.
7. Adicione a suspensão de gel numa coluna Spin-X não estéril de 45 μm e centrifugue a 650 × g durante 5 minutos à temperatura ambiente para remover os detritos do gel. É útil cortar a ponta da pipeta primeiro para alargar a abertura antes de carregar na coluna.
8. Concentre a biblioteca de cDNA eluída por precipitação em etanol durante a noite a -80 °C utilizando as seguintes proporções: Para 300 μL de eluído, adicione 2 μL de GlycoBlue (5 mg/mL), 30 μL de NaOAc 3 e 975 μL de etanol absoluto. Deixe a mistura a -20 °C ou -80 °C durante a noite.
9. Centrifugar a 20.000 × g durante 20 min a 4 °C.
10. Remova o sobrenadante e lave o pellet com 80% de etanol.
Deixe secar ao ar durante 5–10 minutos e ressuspenda em 12 μL de água livre de nucleases.
12. Execute o produto em um segundo gel de poliacrilamida a 8% e repita os passos 1–11 desta seção para remover quaisquer outros produtos de tamanho indesejado.
13. Envie a biblioteca de cDNA para sequenciação. Para bibliotecas de sRNA, normalmente sequenciamos a uma profundidade padrão de 20 milhões de leituras por amostra.