Explorando o Ciclo Celular a Partir de uma Perspectiva de Transcriptoma de Célula Única

A divisão celular é um processo biológico fundamental com características e mecanismos básicos conservados em todos os eucariotos. O processo que ocorre entre o início do crescimento de uma nova célula produzida pela divisão celular e o final da próxima divisão celular para formar células-filhas é geralmente referido como ciclo celular. O ciclo celular contém quatro fases: G1, S, G2 e M. É uma série de eventos em que o DNA celular se replica, cresce e se divide.

Entre os tecidos, até mesmo células do mesmo tipo podem estar em diferentes ciclos celulares. Métodos tradicionais de estudo do ciclo celular, como experimentos de coloração com PI (iodeto de propídio) e detecção de moléculas relacionadas, têm desvantagens, como experimentos complicados, marcadores disponíveis limitados, maior dificuldade em encontrar células em estados intermediários e dificuldade em analisar genes-chave no processo. Em contraste, a tecnologia de célula única oferece uma nova direção para a pesquisa do ciclo celular devido à sua relativa simplicidade, à disponibilidade de um grande número de perfis de expressão gênica, à capacidade de capturar células raras e à capacidade de encontrar genes-chave sem informações a priori.

A Análise de Pseudotempo na Pesquisa do Ciclo Celular

As células começam a se dividir após uma série de pontos de verificação para o crescimento e preparação da divisão. Esses passos são controlados pela atividade de proteínas específicas que são reguladas em tempo e espaço por regulação transcricional, modificações pós-traducionais e degradação de proteínas. Estudos do ciclo celular mostraram que centenas de genes e proteínas são regulados pelo ciclo celular. Uma das vantagens do sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) é a análise de pseudotempo. A análise de pseudotempo é usada para inferir o curso das mudanças celulares a partir de resultados de dados estáticos, construindo trajetórias de mudanças intercelulares. Em termos de análise de classificação específica e complexidade, a análise de pseudotempo pode ser dividida em análise de trajetória celular e análise de genealogia celular.

A análise de trajetória celular refere-se à mudança de células ao longo de uma direção específica, e a trajetória tem um ponto de partida e um ponto final mais simples; a análise de genealogia celular geralmente refere-se a células progenitoras com múltiplas trajetórias e destinos de desenvolvimento sob condições específicas, e o processo de mudança assemelha-se a uma estrutura complexa em forma de árvore. Além disso, a análise de agrupamento permite a reconstrução de processos contínuos do ciclo celular. Ao analisar genes expressos especificamente, novos genes com associações desconhecidas com a divisão celular e o ciclo celular podem ser identificados, por exemplo, outros genes dependentes do ciclo celular (CCD) podem ser descobertos de forma eficiente usando scRNA-seq, etc.

Análise de expressão diferencial baseada em trajetória. (Van den Berge et al., 2020)

Exceto pelo scRNA-seq, os estudos do ciclo celular são geralmente realizados em populações celulares sincronizadas que são afetadas pela expressão gênica, morfologia celular e alterações metabólicas, o que limita a exploração das mudanças de expressão nas fases do ciclo celular. Portanto, além dos estudos sobre regulação de sinalização do desenvolvimento, mecanismos moleculares e mecanismos de resistência, o scRNA-seq tem sido amplamente utilizado em estudos do ciclo celular, por exemplo, questões clássicas como desenvolvimento de características biológicas, questões sobre a capacidade regenerativa dos tecidos após trauma e meiose de células germinativas.

A análise comparativa de genes relacionados ao ciclo celular pode elucidar domínios estruturais específicos do ciclo celular conservados e únicos e também fornecer informações-chave para a análise funcional da progressão do ciclo celular na análise de RNA de célula única e anotação de genes marcadores do ciclo celular. O sequenciamento do transcriptoma de célula única de linhas celulares importantes também pode revelar a heterogeneidade transcricional dependente do ciclo celular presente em táxons celulares. Um progresso contínuo do ciclo celular foi reconstruído por meio de análise de temporização mimética, revelando trajetórias de diferenciação, incluindo entrada e saída do ciclo celular; um conjunto de genes expressos putativos específicos do ciclo celular também foi identificado.

A análise comparativa com genes relacionados ao ciclo celular de outros estudos foi realizada para elucidar domínios estruturais e genes específicos de estágio conservados e distintos. A análise do ciclo celular correlacionada com a análise mimética pode ser aplicada para indicar a condição de células-tronco, identificar o efeito de drogas para bloquear o ciclo celular, etc., e tem aplicações potenciais em processos de diferenciação e desenvolvimento, reparo de danos por doenças e imunogênese tumoral.

A Anotação do Ciclo Celular

Cada fase do ciclo celular possui genes marcadores significativos, e ao analisar a expressão de genes relacionados ao ciclo celular, o ciclo em que uma célula se encontra pode ser anotado. Com base nos genes de assinatura do ciclo e na matriz de expressão de célula única, o estado do ciclo em que uma célula individual se encontra pode ser avaliado para determinar se a célula está em um estado proliferativo.

Progressão do ciclo celular. (Wang 2021)

Em estudos de meiose, porque a meiose das células germinativas nos tecidos não ocorre simultaneamente, é difícil para o transcriptoma comum refletir com precisão os mecanismos de regulação da expressão gênica durante a meiose, e a abordagem de célula única pode resolver bem o problema da heterogeneidade. Na análise do transcriptoma de célula única, o ciclo celular em que cada célula se encontra pode ser inferido a partir dos dados de grupos de genes em estágios específicos do ciclo celular. Por exemplo, células meióticas expressam várias subunidades de histona com proteínas de ligação a microtúbulos, e a expressão combinada de proteínas do ciclo celular e quinases dependentes de proteínas do ciclo celular não aparece nas células originais.

Esse fenômeno pode ser usado para distinguir entre o primeiro estágio da prófase da meiose e a fase celular mitótica. A identificação de genes reguladores do desenvolvimento de células primitivas ao calcular a correlação de cada gene com o ciclo celular que mais se assemelha ao tempo de desenvolvimento proposto é uma análise que pode distinguir genes de diferenciação de células primitivas de genes reguladores do ciclo celular, o que não seria possível usando dados de tecidos inteiros. Pode-se ver que, ao estudar os padrões de expressão de genes específicos em células individuais, células em diferentes estágios do ciclo podem ser efetivamente identificadas e categorizadas.

Células na mesma fase se agrupam entre si, enquanto células em fases diferentes estão claramente separadas e formam um ciclo na distribuição de PCA, o que permite inferir o processo dinâmico do ciclo celular a partir de dados estáticos, resolvendo a dificuldade da heterogeneidade celular e da homogeneização dos dados e permitindo respostas precisas a questões científicas a nível celular.

Impacto do Ciclo Celular na Análise de Dados

Ao realizar estudos do ciclo celular, os tecidos podem conter duas populações celulares muito diferentes, por exemplo, contendo células que estão proliferando e células que estão quiescentes ou senescentes, e métodos que utilizam ensaios moleculares podem apenas relatar um estado intermediário, que não reflete verdadeiramente nenhum dos tipos celulares.

Ao focar na heterogeneidade dos tipos celulares, o ciclo celular pode ser considerado como o principal viés sistemático. Nos dados do transcriptoma de célula única, células do mesmo tipo frequentemente vêm de diferentes estágios do ciclo celular, o que pode afetar a análise de agrupamento a jusante, manifestando-se como a divisão do mesmo tipo de células em diferentes populações celulares. Além disso, ao realizar o agrupamento celular, diferentes tipos de células podem estar em um estado proliferativo e serem agrupadas em grupos devido à alta expressão de genes relacionados ao ciclo celular, o que é, na verdade, uma mistura de múltiplas células. Portanto, a necessidade de remover o efeito do ciclo celular no agrupamento deve ser considerada durante a análise, com base na compreensão de todo o experimento.

A análise do ciclo celular nos permite entender o estado em que as células se encontram, e quando os resultados do agrupamento são fortemente influenciados pelo ciclo celular, a influência do ciclo celular precisa ser removida com base na questão científica em estudo, deixando a fração biologicamente significativa. Se a fração for muito pequena, também é possível optar por não tratá-la. Além disso, combinar diferentes tipos de análise de célula única, como imagem de células vivas com biossensores fluorescentes com transcrição ou genômica de célula única, para vincular o comportamento molecular de uma célula ao seu destino subsequente pode ser uma direção importante para a pesquisa do ciclo celular.

Conclusão

Em geral, estudos de célula única podem abordar a questão da heterogeneidade celular. Por meio do sequenciamento do transcriptoma de célula única combinado com análise de agrupamento e análise de temporização mimética, podemos reconstruir o processo contínuo do ciclo celular e, assim, inferir o estado de valor agregado celular; ao analisar genes expressos especificamente, podemos descobrir genes conhecidos e desconhecidos associados à divisão celular e ao ciclo celular; ao analisar as informações moleculares das células, podemos inferir o destino de diferenciação e desenvolvimento das células, etc. Pode-se dizer que os estudos do ciclo celular em célula única têm um importante potencial de aplicação na regulação da sinalização do desenvolvimento, reparo de danos por doenças, imunogênese tumoral, etc.

Referências:

1. Van den Berge, Koen, et al. "Análise de expressão diferencial baseada em trajetória para dados de sequenciamento de célula única." Nature communications 11.1 (2020): 1201.
2. Wang, Zhixiang. "Regulação da progressão do ciclo celular pela sinalização celular induzida por fatores de crescimento." Cells 10.12 (2021): 3327.