Protocolo de Sequenciação de RNA de Célula Única

Preparação de Placas de Coleta

Limpeza do Espaço de Trabalho e Preparações

1. Limpe a área de trabalho com etanol a 70% (v/v) e toalhetes DNA-Off.
2. Descongele alíquotas dos reagentes (buffer de lise de células únicas) no gelo ou a 4°C.
3. Metal frio em cima de gelo ou a 4°C.
4. Uma vez que todos os reagentes estejam descongelados, misture-os vigorosamente.

Coloque a Solução de Lise de Células Únicas nas Placas

1. Prepare o tampão de lise de células únicas num tubo de microcentrífuga. Misture-o invertendo o tubo pelo menos dez vezes e colete no fundo com uma rápida centrifugação numa microcentrífuga (5-10 seg a menos de 1000 g). Evite agitar a solução de lise de células únicas, pois o detergente irá espumar e sequestrar células desnecessariamente.
2. Monte as placas de quadro de PCR (quatro placas de 24 poços por quadro para uma placa de 96 poços) e coloque-as num suporte de metal bem frio para arrefecer.
3. Transfira 3 μL do tampão de lise de células únicas para cada poço utilizando uma pipeta multicanal.
4. Feche as placas de PCR. Colete a solução de lise no fundo dos poços por centrifugação durante 15 segundos a <2000 g.
5. Mantenha os pratos no gelo para uso durante o dia.

Dissociação

Preparativos

Uma hora antes de iniciar a dissociação, suplementar a cultura celular com 5 μM do inibidor ROCK Y-27632. Este é incluído em todos os passos subsequentes para prevenir a apoptose durante a dissociação e processamento.
2. Prepare uma quantidade suficiente de tampão FACS, diluição de trabalho do iodeto TO-PRO-3 e solução de bloqueio de pontas.
3. Aquecer o TrypLE Express suplementado com 5 μM do inibidor ROCK Y-27632.

Dissociação e Coloração

1. Remova suavemente o meio das células cultivadas em placas de 12 poços com uma micropipeta.
2. Lave suavemente e sem agitação com 2 mL de HBSS.
3. Adicione 0,5 mL de TrypLE Express suplementado com 5 μM do inibidor ROCK Y-27632 por poço.
4. Incubar a 37°C em um agitador orbital a ≤100 rpm. Após 20 minutos, pipetar suavemente para cima e para baixo as células 10-12 vezes, seguido de uma nova incubação com agitação. Repetir a pipetagem a cada 5 minutos até formar uma suspensão de células individuais.
5. Entretanto, adicione iodeto TO-PRO-3 ao tampão FACS até uma concentração final de 1 μM (exceto para o controlo não corado).
6. Colete as células e centrifugue a 200g durante 4 minutos.
7. Para a primeira amostra, inclua também as células fixadas em etanol e centrifugue-as também.
8. Ressuspenda em 300 μl de tampão FACS e filtre através de uma tampa de malha de filtro FACS.
9. Manter a suspensão de células individuais em tampão FACS sobre gelo.
10. Proceda à FACS das células dentro de 30 minutos.

Amostra de Controlo de Células Mortas Manchadas

1. Prepare 70% de etanol fresco com etanol absoluto e água destilada. Transfira 3 ml para um tubo FACS e mantenha-o em gelo.
2. Dissocie as células com TrypLE Express como acima.
3. Resuspenda em 5 ml de meio e centrifugue a 200 g durante 4 minutos.
4. Coletar células em 500 μl de HBSS.
5. Deite lentamente a suspensão celular no etanol a 70% frio enquanto agita vigorosamente o tubo FACS para evitar agregados celulares. Não deixe que gotas da suspensão celular caiam diretamente sobre o plástico.
6. Deixe as amostras em gelo durante pelo menos 1 h para permeabilizar.
No dia da coleta de células unicelulares, centrifugue e ressuspenda as células fixadas e permeabilizadas em 300 μL de tampão FACS com iodeto TO-PRO-3.

Classificação de Células Vivas Assistida por Fluorescência (FACS)

Preparações e Configurações do Citómetro de Fluxo

1. Caixa de gelo com as placas de coleta preparadas.
Caixa de gelo seco com suporte metálico refrigerado para congelamento rápido dos lisados de células únicas.
3. Centrífuga para centrifugar as placas de coleta.
4. Selos adesivos.
5. Caixa de gelo com as amostras.

Estratégia de Ordenação

1. A partir de allevents: No FSC-H×SSC-H, selecione células do tamanho e granularidade apropriados (gateP1) para excluir detritos.
2. A partir do gateP1: No FSC-A×FSC-W, selecione singletes (gateP2).
3. Do gateP2: No SSC-A×SSC-W, selecione os singlets novamente (gateP3).
4. Do gateP3: No FSC-H×TO-PRO-3 iodeto, separe o soma vivo (gateP4) do soma morto, corpos apoptóticos e outros detritos grandes.

Coleção

1. A partir do gateP4 (soma viva), classifique um evento (célula) por poço e dispense um volume de 5 nL em 3 μL de tampão de lise.
2. Após terminar de recolher um prato, coloque-o num suporte metálico gelado dentro da unidade de fluxo laminar e selá-lo imediatamente com película de selagem.
3. Colete os lisados no fundo dos poços por centrifugação durante 15 segundos a <2000 g.
4. Coloque imediatamente o prato sobre um suporte metálico resfriado com gelo seco para congelar instantaneamente os lisados de células únicas.
Coloque os pratos num saco zip-lock arrefecido com gelo seco.
6. Armazenar a -80°C até ao processamento dos lisados.

Bibliotecas de cDNA Smart-Seq2 de Células Únicas

Preparações

1. Limpe a área de trabalho com etanol a 70% e toalhetes.
2. Descongele alíquotas de reagentes sobre gelo.
3. Prateleiras de metal frias sobre gelo.
4. Uma vez que todos os reagentes estejam descongelados, misture vigorosamente.

Síntese da Primeira Cadeia

1. Prepare a mistura de reação para a síntese da primeira cadeia. Inverta o tubo e colete com uma rápida centrifugação em um microfuge.
2. Defina o termociclador para 72°C.
3. Coloque os lisados congelados num suporte metálico frio. Feche a tampa de plástico com a ajuda de uma espátula.
4. Centrifugar durante 15 segundos a <2000 g e coletar os lisados celulares no fundo.
5. Remova as tiras de tubos de PCR da placa de 96 poços. As tiras estão unidas pelo selo de plástico. Selar firmemente e cortar o excesso da borda do selo de plástico.
6. Coloque os tubos no termociclador, coloque a tampa e incube a 72°C durante 3 minutos. Este é o passo de desnaturação da transcrição reversa.
7. Coloque os tubos de PCR de volta na placa de 96 poços. Arrefeça imediatamente em gelo durante pelo menos 2 minutos.
8. Enquanto as amostras arrefecem, inicie o programa do termociclador "1_RT_10" para aquecer a 42°C.
9. Colete as amostras através de uma breve centrifugação. Remova o selo com cuidado e coloque a placa emoldurada Piko PCR sobre um suporte metálico frio.
10. Distribua a mistura de reação da primeira fita em uma tira de oito poços (36,5 μL por poço). Adicione 2,76 μL da mistura de reação da primeira fita ao lado de cada poço com lisado de célula única usando uma pipeta multicanal.
11. Selar a placa emoldurada de PCR.
12. Combine a reação de síntese da primeira fita com os lisados por centrifugação durante 15 segundos a <2000 g.
13. Cubra o prato com uma tampa de plástico.
14. Remova as tiras de tubos de PCR da placa de 96 poços. As tiras estão unidas pelo selo de plástico.
15. Selar bem e cortar o excesso da borda do selo de plástico.
16. Coloque a placa no termociclador e adicione a tampa.
17. Execute o programa "1_RT_10".

Síntese e Amplificação da Segunda Cadeia

1. Prepare a mistura de reação para a síntese da segunda cadeia em gelo, num tubo de microcentrífuga. Misture a mistura de reação da síntese da segunda cadeia por inversão e colete por centrifugação durante 15 segundos a <2000 g.
2. Distribua a mistura de reação da segunda cadeia em uma tira de oito poços (100 μL por poço) como um reservatório para pipetagem.
3. Remova as amostras da reação de síntese da primeira fita do termociclador. Coloque imediatamente os tubos de PCR Piko de volta na estrutura da placa de 96 poços e sobre um suporte metálico frio.
4. Inicie o programa do termociclador "2_ISP_21".
5. Selar com uma folha de plástico e coletar as reações por centrifugação breve durante 15 segundos a <2000 g. Colocar a placa em moldura Piko PCR sobre um suporte metálico frio e remover cuidadosamente o selo.
6. Adicione 7,5 μL da mistura de reação da segunda cadeia ao lado de cada poço com as amostras usando uma pipeta multicanal.
7. Selar a placa emoldurada de PCR. Combine a reação com uma breve centrifugação durante 15 segundos a <2000 g.
8. Remova as tiras de tubos PCR da placa emoldurada. As tiras estão unidas pelo selo de plástico. Selar bem e cortar o excesso da borda do selo de plástico.
9. Coloque os tubos de reação da segunda fita no termociclador, adicione a tampa e execute o programa "2_ISP_21" (continue para o segundo passo). Esta é a etapa de síntese e amplificação da segunda fita.

Purificação da Biblioteca de cDNA

1. Equilibre as esferas SPRI (19,5% PEG-8k) à temperatura ambiente durante pelo menos 20 minutos.
2. Distribua as esferas magnéticas em uma tira de oito poços (220 μL por poço).
3. Coluna por coluna, adicione 12,5 μL de esferas por poço a uma placa de 96 poços profundos utilizando uma pipeta multicanal.
4. Remova as amostras do termociclador. Coloque os tubos de PCR Piko em tiras no suporte de placas de 96 poços e sobre um suporte metálico frio.
5. Selar a placa com uma tampa de plástico e coletar a reação através de uma breve centrifugação durante 15 segundos a <2000 g. Remover a tampa com cuidado e colocar a placa de 96 poços sobre um suporte metálico frio.
6. Coluna por coluna, utilizando uma pipeta multicanal, transfira as amostras para as placas de poços profundos com as esferas magnéticas. Após cada transferência, misture as esferas e a reação pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
7. Após a última transferência, cubra as amostras e incube à temperatura ambiente durante 8 minutos para permitir que as esferas magnéticas se liguem às amostras.
8. Coloque o prato coberto com as amostras num suporte magnético para recolher as esferas durante 5 minutos.
9. Descarte o sobrenadante sem perturbar as esferas. Seque as esferas durante 10 minutos à temperatura ambiente, sem tampa, enquanto a placa ainda estiver no suporte magnético.
10. Distribua a solução de eluição em uma tira de oito poços (160 μL por poço) como reservatório para o pipete multicanal. Enquanto as amostras ainda estiverem no suporte magnético, adicione 13 μL de solução de eluição por poço.
11. Remova a placa do suporte magnético. Coluna por coluna, ressuspenda as esferas na solução de eluição pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
12. Cubra a placa de poços profundos e incube-a à temperatura ambiente durante 5 minutos para libertar as amostras das esferas.
Coloque a placa de poços profundos no suporte magnético e ligue as esferas por mais de 2 minutos.
14. Rotule 12 tiras de oito poços com baixa ligação a ácidos nucleicos e coloque-as num suporte metálico frio.
15. Coluna por coluna, transfira 12 μL do eluído da placa no suporte magnético para tiras de oito poços.
Durante a transferência, não perturbe as esferas. Após a transferência e a recolha de amostras para quantificação, sele as tiras de oito poços e congele a -20°C.

Quantificação e Controlo de Qualidade de Bibliotecas de cDNA de Células Únicas

Quantificação de Biblioteca de cDNA de Célula Única

1. Pipetar 49 μL de solução de ensaio por poço em placas de ensaio pretas de 96 poços para amostras. Manter as placas de ensaio no escuro.
2. Colete as bibliotecas de cDNA de célula única por centrifugação das placas de armazenamento durante 15 segundos a <2000 g. Remova cuidadosamente a folha de selagem.
3. Coluna por coluna, transfira 1 μL de cada biblioteca de cDNA de célula única diretamente para a solução de ensaio numa placa de ensaio preta. Mantenha a placa de ensaio no escuro.
4. Após completar a transferência, sele a placa de armazenamento com as bibliotecas de cDNA de célula única. Colete-as no fundo do poço através da centrifugação das placas de armazenamento durante 15 segundos a <2000 g, e armazene a -20°C.
5. Prepare os padrões para a calibração do ensaio. Coloque 47,5 μL da solução do ensaio por poço e adicione 2,5 μL dos padrões. Utilizamos quatro réplicas de cada padrão 1 (0 ng/μL dsDNA, fundo) e padrão 2 (10 ng/μL dsDNA, limite superior).
6. Após preparar ambas as amostras e os padrões, medimos o sinal de fluorescência num espectrofluorómetro (excitação a 485 nm/emissão a 530 nm). A concentração da biblioteca de cDNA de célula única é calculada de acordo com a seguinte equação com o fator de diluição f._Diluição=50 e os valores médios dos padrões.
7. Após a conclusão das medições, descarte as placas de ensaio.

Controlo de Qualidade de cDNA

1. Para cada pool de cDNA de célula única, prepare uma tira de oito tubos.
2. Colete as bibliotecas de cDNA de célula única por centrifugação das placas de armazenamento durante 15 segundos a <2000 g. Remova cuidadosamente a folha de vedação.
3. Coluna por coluna, combine 1 μL de cada biblioteca de cDNA de célula única em uma tira de oito tubos.
4. Após completar a transferência, sele a placa de armazenamento com as bibliotecas de cDNA de célula única. Colete-as no fundo do poço por centrifugação das placas de armazenamento durante 15 segundos a <2000 g e armazene a -20°C.
5. Combine o conteúdo de cada tubo da tira de oito tubos em um único tubo. Esta é a amostra de biblioteca de cDNA de células únicas agrupadas para perfilagem no Bioanalyzer.
6. Siga as instruções do kit de DNA de Alta Sensibilidade (ou similar) e analise os traços do perfil de cDNA.

Referência:

1. Schweingruber C, Nijssen J, Benitez J A, et al. mRNA-Seq de Células Únicas de Neurónios Humanos Derivados In Vitro Usando Smart-Seq2[M]//Redes Regulatórias de Fatores de Transcrição. Humana, Nova Iorque, NY, 2023: 143-164.