Sequenciação de RNA 5-Metilcitosina (m5C) pelo Protocolo Illumina

Extração, Purificação e Tratamento com DNase de RNA

O RNA total é extraído e purificado diretamente do tecido com 1 mL de TRIzol™ de acordo com o protocolo do fabricante. O RNA é então tratado com TURBO™ DNase conforme o protocolo do fabricante. Avalie a integridade do RNA utilizando um RNA 6000 Nano Chip no Agilent 2100 Bioanalyzer de acordo com o protocolo do fabricante.

Geração do Controlo de Transcrição Spike-in MGFP In Vitro

1. Linearize o vetor phMGFP utilizando a enzima de restrição XbaI e purifique o DNA vetorial linearizado de acordo com o protocolo do Kit de Transcrição In Vitro HiScribe T7.
2. Realize a transcrição in vitro de acordo com o protocolo do Kit de Transcrição In Vitro HiScribe T7 utilizando 1μg de DNA linearizado. Um período de incubação de 4 h a 37 °C com os componentes do kit é suficiente.
3. Adicione 2 U de TURBO™ DNase e incube a 37 °C durante 30 min.
4. Transfira a reação para um tubo Phase Lock Gel™ e complete o volume da reação até 100μL com água ultrapura H2O.
5. Adicione um volume igual de fenol:água e cloroformo, agite vigorosamente durante 15 s e centrifugue a 15.000 × g durante 5 min.
6. Adicione o mesmo volume de cloroformio que no passo 5 ao tubo, agite vigorosamente durante 15 segundos e centrifugue a 15.000 × g durante 5 minutos novamente.
7. Transfira a fase aquosa para um tubo limpo de 1,5 mL. Adicione 1/10 do volume de 3 M acetato de sódio, 3 volumes de etanol a 100% e 1μL de glicogénio; vortexe; e precipite o RNA durante a noite a −80 °C.
8. Centrifugar o RNA a 17.000 × g a 4 °C durante 60 min e remover cuidadosamente o sobrenadante.
9. Adicione 1 mL de etanol a 75% ao RNA, inverta cinco vezes e centrifugue a 7500 × g a 4 °C durante 10 min.
10. Remova cuidadosamente o sobrenadante e deixe o pellet secar ao ar durante aproximadamente 15 minutos.
11. Ressuspenda o RNA em 25μL de H ultrapuro.₂O.
12. Passo opcional: Tratar 5μg de transcrito MGFP transcrito in vitro com 2 U de TURBO™ DNase de acordo com o protocolo do fabricante a 37 °C durante 30 min.
13. Avalie a integridade e o tamanho dos transcritos MGFP in vitro utilizando um RNA 6000 Nano Chip no Agilent 2100 Bioanalyzer de acordo com o protocolo do fabricante.

Conversão de Bisulfito de RNA

1. Adicione 1/2000 do transcrito de RNA MGFP a 2μg de RNA total purificado tratado com DNase. Aumente o volume da amostra de RNA para 20μL com H2O ultrapura.
2. Desnaturar o RNA aquecendo a 75 °C durante 5 minutos num bloco de aquecimento.
3. Pré-aqueça a solução de bisulfito de sódio a 75 °C, adicione 100μL ao RNA, agite bem e centrifugue brevemente em uma microcentrífuga (13.000 × g durante 1 min).
4. Sobreponha a mistura de reação com 100μL de óleo mineral. Cubra o tubo com papel de alumínio para proteger a mistura de reação da luz.
5. Incubar a 75 °C durante 4 h num bloco de aquecimento.
6. Cerca de 15 minutos antes de a reação de conversão com bisulfito estar completa, prepare duas Colunas Micro Bio-Spin para cada reação de conversão, permitindo que a solução de Tris na coluna drene para um tubo de coleta. Descarte o fluido de Tris, coloque a coluna de volta no tubo de coleta e centrifugue a 1000 × g durante 2 minutos. Transfira cada coluna para um tubo limpo de 1,5 mL.
7. Remova a mistura de reação de bisulfito do bloco de aquecimento e transfira gentilmente a camada aquosa (que está sob o óleo mineral) contendo a mistura de bisulfito de sódio/RNA para a coluna Micro Bio-Spin.
8. Centrifugar a 1000 × g durante 4 min.
9. Transfira cuidadosamente o eluído para a segunda coluna Micro Bio-Spin colocada num tubo de 1,5 mL e repita o passo 8.
10. Pré-aqueça a temperatura do bloco de aquecimento a 75 °C em preparação para o passo 12.
11. Adicione um volume igual de 1 M Tris–HCl pH 9.0 ao segundo eluato, agite em vortex, centrifugue brevemente e, em seguida, sobreponha com 175μL de óleo mineral. Cubra o tubo com papel de alumínio para proteger a mistura de reação da luz.
12. Incubar a 75 °C durante 1 h no bloco de aquecimento.
13. Transfira a camada aquosa inferior contendo o RNA para um tubo limpo de 1,5 mL.
14. Precipitar o RNA tratado com bisulfito e ressuspender o RNA convertido com bisulfito em H.₂O.

Design de Primers Oligonucleotídeos de Bisulfito para Síntese de cDNA e PCR

1. Para uma amplificação paralela eficiente de 48 amplicons-alvo no Fluidigm Access Array, utilize a síntese de cDNA direcionada para reduzir a amplificação de amplicons espúrios. A síntese de cDNA direcionada é alcançada através do design de primers de transcriptase reversa (RT) a 30–40 nt 3' da(s) citosina(s) a serem analisadas.
2. Desenhe primers para a primeira ronda de amplificação por PCR de forma a que os pequenos amplicons tenham entre 170–200 bp, para permitir uma amplificação eficiente. Como o conteúdo de G/C no template é baixo, desenhe primers longos para garantir que a Tm esteja na faixa de 59–61 °C. Adicione a sequência CS1 (5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT-3') à sequência específica do gene (GSS) do primer direto e CS2 (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACA-3') à GSS do primer reverso. Para a segunda amplificação por PCR, utilize o primer direto contendo as sequências complementares para a célula de fluxo P5 da Illumina combinado com CS1 (P5_CS1) e o primer reverso contendo o código de barras e as sequências complementares para a célula de fluxo P7 da Illumina combinado com CS2 (P7_BC_CS2).

Síntese de cDNA

Misture 500 ng de RNA convertido em bisulfito, 1μL de mistura de dNTP a 1 mM e 2μL de mistura de primers em pool a 10× e adicione H ultrapuro.₂O a um volume final de 13μL. Incubar a mistura a 65 °C durante 5 min para desnaturar o RNA.
2. Transcreva reversamente o RNA convertido em bisulfito utilizando a SuperScript™ III Reverse Transcriptase de acordo com o protocolo do fabricante. Adicione either 48 primers RT em pool para amplificação paralela do Access Array ou hexâmeros aleatórios para amplicons de PCR único.
3. Após a reação estar completa, dilua os cDNAs 1:10 em água ultrapura.₂O para amplificação por PCR.

Amplificação, Quantificação e Agrupamento de PCR Individual

1. Para uma PCR de 10μL, adicione 0,2μL de KAPA HiFi DNA Polymerase, 2μL de tampão de alta fidelidade 5× (com MgCl2), 0,3μL de dNTP a 10 mM, 0,4μL de primer direto a 10μM (CS1_GSS), 0,4μL de primer reverso a 10μM (CS2_GSS), 1μL de cDNA diluído e H2O até um volume final de 10μL. Realize a PCR para cada amplicon em triplicado.
2. Agite suavemente com os dedos, centrifugue brevemente e coloque num termociclador pré-aquecido.
3. Realizar um programa de PCR de ciclagem térmica em duas etapas.
4. Agrupe os triplicados e realize uma limpeza com esferas AMPure numa proporção de 1.8:1 para remover primers não incorporados e dímeros de primers. Repita este passo.
5. Avaliar o tamanho e a concentração do amplicão de PCR após separação num Sistema de Eletroforese em Microchip Shimadzu MCE®-202 MultiNA.
6. Normalize a concentração de cada amplicon no experimento por diluição com H2O para uma concentração na faixa de 0,5–5 ng/μL.
7. Realize a PCR de barcoding e adição do adaptador Illumina. Numa PCR de 10μL, adicione 0,2μL de KAPA HiFi DNA Polymerase, 2μL de tampão 5× HiFi Fidelity (com MgCl2), 0,3μL de dNTP a 10 mM, 1μL de primer forward a 10μM (P5_CS1), 1μL de primer reverse a 10μM (P7_CS2), 2μL de amplicão PCR diluído e H2O até um volume final de 10μL.
8. Agite suavemente, centrifugue brevemente e coloque num termociclador pré-aquecido.
9. Realize um programa de PCR com ciclagem térmica em duas etapas.
10. Avaliar o tamanho e a concentração do amplicão de PCR após separação num Sistema de Eletroforese em Microchip Shimadzu MCE®-202 MultiNA.
11. Agrupe os amplicões em concentração equimolar e purifique-os utilizando esferas AMPure de acordo com o protocolo do fabricante. Utilize uma proporção de esferas para amplicões agrupados de 0,9:1 para garantir a ligação dos amplicões e não de dímeros de primers ou primers não incorporados.
12. Primeiro, estime a concentração de DNA utilizando um Kit de Ensaios Qubit dsDNA de Ampla Gama de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, avalie com precisão a concentração de DNA utilizando o Kit de Quantificação de Bibliotecas KAPA para Plataformas Illumina®. Realize uma diluição seriada dos amplicões agrupados de forma a que fiquem dentro da faixa dinâmica do ensaio de 5,5–0,000055 pg/μL.

Sequenciação MiSeq

1. Prepare a folha de amostras utilizando o Illumina Experiment Manager, seguindo o protocolo do fabricante.
2. Dilua a biblioteca para 10 nM em tampão EBT com base nas concentrações determinadas pela qPCR. A partir deste ponto, mantenha as bibliotecas em gelo.
3. Dilua a biblioteca de controlo PhiX para 2 nM adicionando 8μL de tampão EBT a 2μL da biblioteca de controlo PhiX a 10 nM.
4. Desnaturar as bibliotecas agrupadas e a biblioteca de controlo PhiX separadamente, adicionando 10μL de NaOH 0,2 M a 10μL das bibliotecas de 2 nM.
5. Vortexe bem para misturar e centrifugue a 1000 × g durante 30 s. Incube à temperatura ambiente durante 5 min.
6. Dilua as bibliotecas agrupadas desnaturadas e a biblioteca de controlo PhiX separadamente para 20 pM, adicionando 980μL de HT1 pré-arrefecido a 20μL de bibliotecas desnaturadas.
7. Diluam as bibliotecas agrupadas de 20 pM e a biblioteca de controlo PhiX separadamente para 10 pM, adicionando 500μL de HT1 pré-arrefecido a 500μL das bibliotecas de 20 pM.
Combine 100μL da biblioteca de controlo PhiX a 10 pM com 900μL das bibliotecas agrupadas a 10 pM e vortex para misturar.
9. Carregue 600μL da amostra final no cartucho. Certifique-se de que as bolhas de ar são removidas batendo suavemente no cartucho.
10. Execute a corrida de sequenciação de acordo com o protocolo do fabricante.

Referência:

1. Li J, Wu X, Do T, et al. Perfilagem Quantitativa e de Resolução de Nucleotídeo Único de 5-Metilcitosina de RNA[M]//Modificações de RNA. Humana, Nova Iorque, NY, 2021: 135-151.