Direcções Futuras da Sequenciação CUT&Tag: Integração de Multi-ómi cas e Automação

Sequenciação CUT&Tag, como uma tecnologia poderosa, tornou-se uma ferramenta importante para o estudo do epigenoma, proporcionando insights profundos sobre a organização espacial e funcional da cromatina. Ao combinar ensaios de acessibilidade de DNA direcionados com sequenciação de próxima geração (NGS), o CUT&Tag oferece uma visão de alta resolução das interações proteína-DNA. À medida que o campo continua a evoluir, a direção futura da tecnologia CUT&Tag irá focar cada vez mais em dois aspectos-chave: integração de multi-ômicas e automação. Esses desenvolvimentos prometem melhorar a nossa compreensão de sistemas biológicos complexos e aumentar a eficiência experimental.

1. Integração Multi-ômica: De Marcadores Únicos a Análise Panorâmica

A tecnologia CUT&Tag está a avançar de uma análise de modificações proteicas individuais ou fatores de transcrição para a integração de dados epigenéticos multidimensionais. Por exemplo, o Spatial CUT&Tag–RNA-seq permite o perfilamento simultâneo de modificações de histonas (por exemplo, H3K27me3, H3K4me3, H3K27ac) e expressão génica (RNA) na mesma secção de tecido numa plataforma de ómica espacial, revelando dinâmicas espaciotemporais na regulação génica. Além disso, abordagens de multi-ómica de célula única, como o scNano-CUT&Tag, quando combinadas com sequenciação de long-read, permitem a deteção precisa de modificações da cromatina mesmo em regiões genómicas complexas — incluindo sequências repetitivas e regiões estruturalmente variáveis — e suportam a análise regulatória específica de alelos. Olhando para o futuro, o CUT&Tag pode ser integrado com metabolómica e proteómica para construir uma rede regulatória "epigenética-transcricional-metabólica" multidimensional, avançando assim o desenvolvimento da medicina de precisão.

• Por exemplo, o espaço de Zhang D ATACAs tecnologias de RNA-seq e CUT&Tag-RNA-seq espacial permitem a análise co-espectral em todo o genoma do epigenoma (acessibilidade da cromatina/modificações de histonas) e do transcriptoma em secções de tecido. Isto revela as correlações espaciotemporais entre as modificações de histonas e a expressão génica (por exemplo, a correlação positiva entre as ondas de repressão H3K27me3 e os marcadores de ativação), a regulação específica de regiões e a distribuição espacial de tipos/estados celulares, proporcionando um novo paradigma de "multi-ómica espacial" para entender a regulação génica no desenvolvimento, na neurociência e na doença.
• CUT&Tag–RNA-seq Espacial: Usando anticorpos direcionados a modificações de histonas (inibição de H3K27me3, ativação de H3K27ac, promotor ativo H3K4me3) combinados com o complexo Protein A-Tn5, os locais de modificação de histonas são rotulados via CUT&Tag, resultando em um panorama abrangente de modificações de histonas além de dados do transcriptoma.
• Co-espectroscopia Genómica Sem Viés: Pela primeira vez, é alcançada uma análise conjunta de todo o genoma do epigenoma (modificações ATAC/histona) e do transcriptoma na mesma secção de tecido. A qualidade dos dados (distribuição de fragmentos, reprodutibilidade) é comparável às técnicas de modalidade única (por exemplo, reprodutibilidade do ATAC–RNA-seq espacial r=0.98, reprodutibilidade do CUT&Tag–RNA-seq espacial H3K27ac r=0.96).
• Alta resolução e ampla cobertura: Suporta 20-50 μm (contendo 1-25 células/pixel), códigos de barras de 100×100 podem cobrir os hemisférios cerebrais de um rato (10.000 pixels), e o design do canal serpentino pode processar 5 amostras simultaneamente.

Análise de CUT&Tag-RNA-seq espacial do cérebro de ratos pós-parto (Zhang D et al., 2023)

2. Tecnologia de Automação: Da Operação Manual a Linhas Automatizadas de Alto Rendimento

A automação é uma inovação fundamental para a aplicação em larga escala da tecnologia CUT&Tag. Atualmente, as plataformas de imobilização por beads magnéticos (como beads magnéticos de Proteína A/G) padronizaram os passos de incubação e lavagem de anticorpos, encurtando o ciclo experimental para menos de 6 horas e reduzindo significativamente a variabilidade entre lotes.

Relativamente, as empresas desenvolveram sistemas automatizados de manuseio de líquidos que suportam a construção de bibliotecas em paralelo de 96 canais, são compatíveis com estratégias de código de barras para múltiplas amostras e atendem às necessidades de estudos de coorte clínica.

Além disso, a introdução de chips microfluídicos otimiza ainda mais os volumes de reação (níveis de nano-litros), reduzindo o desperdício de reagentes e melhorando a sensibilidade.

Por exemplo, baseando-se na alta eficiência e baixo ruído inerente ao CUT&Tag, Janssens DH et al. desenvolveram uma versão totalmente automatizada chamada AutoCUT&Tag—uma atualização da anterior plataforma AutoCUT&RUN. Este sistema é compatível com o processamento robótico em placas de 96 poços e requer apenas alguns milhares de células para realizar o perfilamento em alta capacidade de modificações de histonas em todo o genoma (por exemplo, H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac) e RNA polimerase II. A qualidade dos dados obtidos é comparável à do CUT&Tag manual (reprodutibilidade r = 0,79 ± 0,093), tornando a plataforma bem adequada para amostras clínicas de pacientes.

Usando o AutoCUT&Tag, a equipa demonstrou que a proteína de fusão KMT2A na leucemia se liga predominantemente a regiões de cromatina ativa (enriquecimento em todo o genoma) e que os seus promotores-alvo frequentemente exibem marcas de cromatina bivalente (H3K4me3 + H3K27me3). A análise de células únicas revelou ainda heterogeneidade intercelular reflexiva da plasticidade de linhagem. Além disso, os investigadores identificaram amostras sensíveis a inibidores de DOT1L/Menin com base em padrões de enriquecimento de alvos, que visam a metilação aberrante de H3K79 e o complexo de transcrição associado ao KMT2Ar, oferecendo uma base funcional para a subtipagem da leucemia e estratégias de tratamento direcionadas.

O perfilamento AutoCUT&Tag revela a sensibilidade terapêutica de amostras de leucemia KMT2Ar à inibição de DOT1L (Janssens DH et al., 2021)

No futuro, plataformas totalmente automatizadas assistidas por robôs (desde o processamento de amostras até à análise de dados) irão levar o CUT&Tag a laboratórios de rotina.

3. Aplicações Clínicas: Da Investigação Básica à Medicina de Precisão

O CUT&Tag demonstra um potencial significativo na tradução clínica:

• Subtipagem de Tumores e Monitorização da Resistência a Medicamentos: Ao detetar modificações como H3K27ac em células tumorais circulantes (CTCs), é possível prever a resposta à quimioterapia e orientar a terapia direcionada. Por exemplo, o CUT&Tag revelou o mecanismo regulador epigenético de H3K18la no PDAC: H3K18la está enriquecido nas regiões promotoras de genes-alvo como TTK/BUB1B, ativando diretamente a sua transcrição e impulsionando a progressão do PDAC (estudos adicionais descobriram que TTK/BUB1B aumenta a glicólise e os níveis de H3K18la através de um ciclo de retroalimentação positiva).
• Rastreamento Dinâmico de Processos: Combinando as características de leitura em tempo real do sequenciamento por nanoporo, o CUT&Tag pode monitorizar continuamente as flutuações dinâmicas das modificações da cromatina na mesma população celular (como as alterações de H3K27ac ao longo de 6 horas), revelando o mecanismo de formação da memória epigenética.
  • Exemplo: Bartosovic M et al. desenvolveram o nano-CUT&Tag (nano-CT), uma técnica que utiliza uma proteína de fusão nanobody-Tn5 para se ligar diretamente a anticorpos primários—eliminando a necessidade de anticorpos secundários—e, assim, simplifica o fluxo de trabalho ao reduzir etapas de lavagem e tempo experimental, enquanto minimiza a perda de amostras, o que aumenta a recuperação nuclear efetiva em 28%–68%. O método suporta amostras de baixo input (25.000–200.000 células) e permite a profilagem multimodal simultânea, como acessibilidade da cromatina (ATAC), a marca ativa H3K27ac e a marca repressiva H3K27me3.
  • Comparado com o scCUT&Tag convencional, o nano-CT produz significativamente mais fragmentos únicos por célula. Por exemplo, em amostras de cérebro de camundongo P19, o número mediano de fragmentos de nano-CT por célula atingiu 3.720—15,8 vezes mais do que o obtido com o scCUT&Tag. O nano-CT também demonstra características de sinal-ruído melhoradas, com uma razão de leitura de pico (FRiP) de 35,9%–52,4%, embora este intervalo difira dos 51,2%–69,9% observados com o scCUT&Tag. Além disso, o número de ciclos de PCR para a construção da biblioteca foi reduzido de 15 ciclos para apenas 6 ciclos.
  • A aplicação de nano-CT à diferenciação da linhagem de oligodendrócitos revelou que a repressão mediada por H3K27me3 ocorre em duas fases distintas: uma repressão inicial de genes neuronais, seguida posteriormente pela repressão de genes relacionados com a glia, como Sox5 e Sox6. Este padrão regulatório dinâmico não pôde ser resolvido apenas pela análise do transcriptoma.

nano-CUT&Tag (nano-CT) (Bartosovic M et al., 2023)

• Análise de amostras raras: A análise epigenómica pode ser realizada com apenas um pequeno número de células (como uma amostra de biópsia de microtumor), oferecendo suporte para amostras clínicas raras. Por exemplo, os investigadores demonstraram que a amplitude das características da cromatina do CUT&Tag (por exemplo, centenas de nucleossomas no domínio H3K27me3) apoia a deteção em amostras esparsas, e tipos de células únicas (por exemplo, células H1 e K562) podem ser distinguidos de forma eficiente através de padrões de enriquecimento de H3K27me3 em todo o genoma.

4. Fluxo de Trabalho Padronizado: De Baseado em Experiência a Baseado em Dados

Atualmente, o fluxo de trabalho experimental do CUT&Tag ainda depende de otimização manual. No futuro, é necessário estabelecer um sistema padronizado para todo o fluxo de trabalho:

• Normas de Controlo de Qualidade: Introduzir parâmetros externos Spike-in (como DNA genómico de E. coli) para calibrar a profundidade de sequenciação, reduzindo a taxa de erro de quantificação entre amostras para abaixo de 8%.
• Ferramentas de Análise de Dados: Atualizar fluxos de trabalho de código aberto como o CUT&RUNTools 2.0, integrando a chamada de picos baseada em HMM para marcas amplas e módulos de clustering de redução de dimensionalidade de célula única, suportando análise integrada multi-ômica com um clique.
• Validação de Reproduzibilidade: Avaliar a estabilidade experimental utilizando métricas como IDR (Taxa de Descoberta Irreproduzível) e FRiP (Frações de Leituras em Picos), e estabelecer uma base de dados de validação de anticorpos (como uma plataforma de triagem de anticorpos a nível de ChIP).

5. Inovação Tecnológica: De Leituras Curtas a Leituras Longas de Molécula Única

A combinação de molécula única sequenciação de leitura longa (SMS) e CUT&Tag estão a ultrapassar os gargalos tecnológicos de sequenciação de nova geração:

• Resolução de Regiões Complexas: a tecnologia scNano-CUT&Tag, através da captura de longos fragmentos de moléculas únicas, pode analisar com precisão as modificações H3K27me3 em regiões de heterocromatina e distinguir diferenças de cópias únicas em elementos genómicos repetitivos.
• Análise Específica de Alelos: Utilizando eventos de transposição que flanqueiam locais de SNP heterozigóticos, podem ser detetadas modificações específicas de alelos dos genes XIST relacionados com a inativação do cromossoma X, fornecendo uma nova ferramenta para a investigação de doenças imprintadas.
• Reconstrução do Genoma Tridimensional: Combinado com Hi-C, resolve as relações de co-localização entre interacções espaciais de cromatina e modificações epigenéticas, revelando mudanças dinâmicas no genoma tridimensional.

Resumo

O futuro desenvolvimento da tecnologia CUT&Tag irá girar em torno de quatro grandes direções: integração multi-ómica, automação de ponta a ponta, aplicação de precisão clínica e inovação tecnológica. Através da colaboração interdisciplinar e da padronização, espera-se que esta tecnologia se torne uma ferramenta central para a análise de redes regulatórias de genes e para a promoção do diagnóstico e tratamento de doenças, abrindo novas paradigmas de pesquisa em áreas como epigenómica de célula única e multi-ómica espacial.

As pessoas também perguntam

Quais são as limitações do cut and tag?

A principal limitação do CUT&Tag-seq é a probabilidade de sobre-digestão do DNA devido ao tempo inadequado da reação Tn5 dependente de magnésio. Uma limitação semelhante existe para contemporâneos. ChIP-Seq protocolos onde a fragmentação de DNA enzimática ou sonificada deve ser otimizada.

Quais são os avanços em omicas de célula única?

A tecnologia de ómicas de célula única avançou rapidamente desde a sua criação, oferecendo uma precisão, resolução e diversidade técnica crescentes para explorar características moleculares específicas das células no cérebro humano e em distúrbios neuropsiquiátricos.

Quais são as vantagens do cut and tag?

Semelhante a outros métodos de perfilagem de cromatina, o CUT&Tag tem algumas vantagens sobre o ChIP-seq: requer entradas baixas, com apenas 100 células, apresenta menor fundo, maior relação sinal-ruído, maior repetibilidade e é um processo mais curto.

Por que é que a multi-óptica é o futuro da análise biológica?

Oferece oportunidades sem precedentes não apenas para entender a biologia ao seu nível mais básico, mas para compreender mais completamente a doença, permitindo um futuro onde tratamentos mais eficazes, seguros e personalizados para uma ampla gama de doenças estejam disponíveis.

Referências:

1. Zhang D, Deng Y, Kukanja P, Agirre E, Bartosovic M, Dong M, Ma C, Ma S, Su G, Bao S, Liu Y, Xiao Y, Rosoklija GB, Dwork AJ, Mann JJ, Leong KW, Boldrini M, Wang L, Haeussler M, Raphael BJ, Kluger Y, Castelo-Branco G, Fan R. Co-perfilamento espacial do epigenoma e transcriptoma de tecidos mamíferos. Natureza. Abril de 2023;616(7955):113-122.
2. Bartosovic M, Castelo-Branco G. Perfilagem de cromatina multimodal utilizando CUT&Tag em célula única baseado em nanobodies. Nat Biotechnol. Jun 2023;41(6):794-805.
3. Li F, Si W, Xia L, Yin D, Wei T, Tao M, Cui X, Yang J, Hong T, Wei R. A regulação positiva entre a glicólise e a lactilação de histonas impulsiona a oncogénese no adenocarcinoma ductal pancreático.. Câncer Molécula. 2024, 6 de Maio; 23(1):90.
4. Janssens DH, Meers MP, Wu SJ, Babaeva E, Meshinchi S, Sarthy JF, Ahmad K, Henikoff S. Perfilagem automatizada CUT&Tag da heterogeneidade da cromatina na leucemia de linhagem mista. Nat Genet. Nov 2021;53(11):1586-1596.