Cut&Tag vs ATAC-seq vs ChIP-seq: Escolhendo o Método Certo de Profilagem Epigenómica

Na investigação epigenética, Cut&Tag, ATAC-seq, e ChIP-seq existem três tecnologias principais, mas os seus princípios, cenários aplicáveis e limitações diferem significativamente. Este artigo compara estas tecnologias com base em dados experimentais e literatura, focando nos seus princípios, vantagens e desvantagens, e cenários de aplicação, para ajudar os investigadores a escolher a melhor abordagem com base nos seus objetivos de pesquisa.

Comparação de Princípios Técnicos

1. ATAC-seq

• Princípio: Utiliza uma transposase Tn5 altamente ativa para clivar regiões de cromatina aberta e inserir adaptadores de sequenciação nos locais de clivagem, capturando diretamente fragmentos de cromatina acessível.
• Características:
  • Sem anticorpos: Reflete diretamente o estado aberto da cromatina.
  • Adequado para células únicas: Requer apenas 500 células.
• Amplitude dinâmica ampla: Pode detectar a distribuição de nucleossomas, locais de ligação de fatores de transcrição, etc.

Visão geral esquemática do protocolo ATAC-seq (Grandi FC et al., 2022)

2. ChIP-seq

• Princípio: Enriquece fragmentos de DNA ligados a proteínas específicas (como modificações de histonas e fatores de transcrição) com anticorpos e, em seguida, utiliza sequenciação para localizar os locais de ligação.
• Características:
  • Alta especificidade: Dependente da qualidade do anticorpo, permitindo a seleção precisa de proteínas específicas.
  • Alvos amplos: Aplicável a modificações de histonas (como H3K4me3), fatores de transcrição, etc.
  • Padrão-ouro tradicional: Método de referência de longa data para investigação epigenética.

Fluxo de trabalho de análise de ChIP-seq (Nakato R et al., 2020)

3. Cortar e Marcar

• Princípio: Uma proteína de fusão composta pela Proteína A/G (ou um nanobody) e a transposase Tn5 (pA/G-Tn5) é utilizada. Através do seu domínio de Proteína A/G, esta proteína de fusão liga-se à região Fc de um anticorpo específico para o alvo, orientando assim a Tn5 para a proximidade da região de cromatina ligada ao anticorpo, a fim de alcançar a clivagem direcionada.
• Características:
  • Baixos requisitos de amostra: Requer tão poucas como 100 células, ou até mesmo uma única célula.
  • Baixo ruído de fundo: Nenhum entrelaçamento ou imunoprecipitação necessário, reduzindo sinais não específicos.
  • Fluxo de trabalho rápido: Ciclo experimental reduzido para 1-2 dias.

O princípio do CUT&Tag e variantes do CUT&Tag (Fu Z et al., 2024)

Comparação de Desenhos Experimentais

Comparação de Entradas Experimentais e Requisitos de Amostra

1. ATAC-seq

• Os núcleos precisam de ser extraídos (amostras frescas são as melhores), a quantidade de células necessária é de 5×10³ a 5×10⁴ células, a concentração de digitonina deve ser otimizada (por exemplo, 0,01% a 0,05%) dependendo dos tipos de células. Para células frágeis ou primárias, são recomendadas concentrações mais baixas (por exemplo, 0,01%) para evitar a lise nuclear.
• Passos Chave:
  • Isolamento nuclear → Clivagem da transposase Tn5 da cromatina aberta → Inserção de adaptadores de sequenciação → Amplificação por PCR e construção da biblioteca.
• Limitações: Requer amostras frescas; ciclos repetidos de congelamento e descongelamento podem facilmente danificar a estrutura do nucleossoma.

2. ChIP-seq

• Entrada Experimental: Requer 10⁵~10⁷ células, requer fixação por entrecruzamento com formaldeído (destrói a ligação dinâmica proteína-DNA), processamento de amostras complexo.
• Passos Chave:
  • Entrelaçamento → Sonicação → Enriquecimento de anticorpos → Remoção de entrelaçamento → Construção da biblioteca.
• Limitações: Alvos de baixa abundância (como fatores de transcrição raros) são facilmente perdidos; a qualidade dos anticorpos afeta diretamente os resultados.

3. Cortar & Marcar

• Entrada Experimental: Apenas 100 células necessárias (ensaio de célula única é viável), não é necessário entrelaçamento, tratamento de permeabilização direta (por exemplo, 0,05% Digitonina).
• Passos-chave: Ligação nuclear a esferas magnéticas → Incubação com anticorpos primários/secundários → Cleavage direcionado pela transposase Tn5 → Construção direta da biblioteca.
• Vantagens: Requisitos de amostra extremamente baixos, adequado para amostras preciosas (como células estaminais embrionárias, tecido de biópsia clínica).

Comparação de Moléculas-Alvo e Resolução

1. ATAC-seq

• Moléculas Alvo: Refletir a acessibilidade da cromatina, incluindo elementos regulatórios como promotores e potenciadores.
• Resolução: Nível de uma única base, mas na análise real, é medida na distribuição de nucleossomas ou na pegada de fatores de transcrição (aproximadamente 150 pb).

2. ChIP-seq

• Moléculas-alvo: Modificações de histonas (por exemplo, H3K4me3), locais de ligação de fatores de transcrição, etc.
• Resolução: 100-200 pb, dependente da especificidade do anticorpo; fatores de transcrição normalmente requerem 20M-40M leituras, enquanto marcas de histonas amplas podem requerer >50M leituras.

3. Cut&Tag

• Moléculas-alvo: Modificações de histonas (por exemplo, H3K4me3), fatores de transcrição de baixa abundância (por exemplo, OCT4).
• Resolução: 100-500 bp, baixo ruído de fundo, picos de sinal mais nítidos.

Comparação do Investimento de Tempo e Fluxo de Trabalho

Alocação Típica de Tempo

• ATAC-seq: Processamento de amostras (~2 dias) → Análise de dados de sequenciação (~3 dias).
• ChIP-seq: Crosslinking e imunoprecipitação (~2 dias) → Chamada de picos e análise diferencial (~3 dias).
• CUT&Tag: Incubação de anticorpos (~1 dia) → Preparação da biblioteca e sequenciação (~1 dia).

Análise a Montante e Seleção de Ferramentas

1. ATAC-seq

• Ferramentas Comuns:
  • Chamada de picos: Chamada de região aberta (Pico): MACS2 (usando os parâmetros --nomodel --shift -75 --extsize 150 para corrigir o viés de clivagem do Tn5). Posicionamento de nucleossomas e análise do estado global da cromatina: HMMRATAC.
  • Anotação funcional: ChIPseeker (anotação de genes), análise de motivos (HOMER).
• Desafios de Análise:
  • Identificação de pegadas de fatores de transcrição em regiões livres de nucleossomas.
  • A análise de integração de dados de célula única é altamente complexa, exigindo fluxos de trabalho especializados de análise de ATAC-seq de célula única (como Signac, ArchR ou cicero) ou análise conjunta com dados de RNA-seq de célula única (onde a integração cross-modal pode ser realizada utilizando ferramentas como Seurat).

2. ChIP-seq

• Ferramentas Comuns:
  • Análise de diferença: DiffBind (pacote R), IDR (avaliação de reprodutibilidade).
  • Análise de motivos: Suite MEME, base de dados JASPAR.
• Desafios de Análise:
  • Correção do efeito de lote de anticorpos (requer controlo de IgG).
  • Processamento de dados com baixo rácio sinal-ruído (requer filtragem rigorosa).

3. Cortar e Marcar

• Ferramentas Comuns:
  • Chamada de picos: Para fatores de transcrição e marcas de histonas 'estreitas', use o modo padrão ou modo de pico estreito do MACS2. Para marcas de histonas 'amplas' (por exemplo, H3K27me3), deve ser utilizado o modo de pico amplo (--broad) do MACS2. Aproveitando as características de alta relação sinal-ruído do CUT&Tag, o SEACR também pode ser selecionado (particularmente adequado para definir limiares quando amostras de controlo não estão disponíveis).
  • Integração multi-ómica: WGCNA (rede de co-expressão), SCENIC (rede regulatória de célula única).
• Desafios analíticos:
  • Redução de dimensionalidade de dados de célula única (UMAP/t-SNE).
  • Ao realizar a chamada de picos com o MACS2, devem ser utilizados os parâmetros --shift -75 --extsize 150 para corrigir o desvio de corte da transposase Tn5 no DNA de cadeia dupla, permitindo assim uma localização mais precisa dos locais de ligação das proteínas.

Comparação de Vantagens e Desvantagens

Seleção de Cenários de Aplicação

1. Casos em que o ATAC-seq é preferido

• Objetivo: Explorar a distribuição de regiões de cromatina aberta ou nucleossomas em todo o genoma.
• Requisitos de Amostra: Quantidade celular suficiente (>1×10⁴), exigindo um estudo dinâmico das mudanças no estado da cromatina (por exemplo, processos de desenvolvimento).
• Estudos de Caso:
  • Jiang S et al. utilizaram ATAC-seq (sequenciação de cromatina acessível por transposase), RNA-seq (sequenciação do transcriptoma) e ensaios de célula única em embriões de rato nos dias 7.5 (E7.5) e 13.5 (E13.5) para construir uma paisagem de acessibilidade da cromatina (ou seja, um mapa de regiões de cromatina aberta que integra localizações espaciais) com informação espacial celular em embriões E7.5.
  • Muto Y et al. realizaram snATAC-seq (medição da acessibilidade da cromatina) e snRNA-seq (sequenciação do transcriptoma) em rins humanos adultos, gerando perfis de acessibilidade da cromatina e do transcriptoma específicos por tipo celular. Este estudo revelou os mecanismos regulatórios epigenéticos da heterogeneidade celular renal, mostrando que a maioria das regiões de cromatina diferentemente acessíveis está localizada em promotores, e uma proporção significativa está intimamente associada a genes diferencialmente expressos (sugerindo que a abertura da cromatina regula diretamente a expressão gênica).
• Limitações: Não consegue distinguir eventos específicos de ligação de proteínas.

Casos em que o ChIP-Seq é preferido

• Objetivo: Validar locais de ligação para fatores de transcrição específicos ou modificações de histonas.
• Condições de amostra: Alta qualidade de anticorpos (grau ChIP), alta abundância do alvo (por exemplo, H3K4me3).
• Estudo de caso:
  • Vonk PJ et al. utilizaram ChIP-Seq para determinar a distribuição da histona H3K4me2 (marcador de atividade transcricional) durante os estágios de desenvolvimento mononucleares/binucleares, revelando os mecanismos regulatórios epigenéticos do desenvolvimento de Schizophyllum commune: foram identificados 6032 e 5889 locais de H3K4me2 nos estágios mononucleares/binucleares, respetivamente, todos altamente enriquecidos perto dos locais de iniciação da tradução dos genes; a paisagem epigenética geral era semelhante, mas foram observados 837 locais diferencialmente enriquecidos (associados a 965 genes), sugerindo uma regulação específica de estágio; no estágio binuclear, o enriquecimento de H3K4me2 foi observado em 6 genes de fatores de transcrição, entre os quais a deleção de fst1 e zfc7 levou a uma paragem do desenvolvimento dos corpos de frutificação (falha na formação de cogumelos maduros).
  • Mazina MY et al. utilizaram a tecnologia ChIP-Seq para analisar a modificação da RNA polimerase II (Pol II) e o complexo regulador de transcrição, revelando a regulação específica de estágio do mecanismo de "pausa" da RNA polimerase II durante a embriogénese de Drosophila. Isso indica que o mecanismo de "pausa" da Pol II na embriogénese de Drosophila é específico de estágio: o estágio intermédio é o estado de "pós-pausa" (caracterizado pela transição da fosforilação Ser5P para Ser2P, com Ser2P já ativado), e outro processo é a pausa clássica próxima ao promotor (marcada por baixos níveis de Ser2P). Isso sugere que a composição do complexo de "pausa" (estado de fosforilação, proteínas de ligação) se ajusta dinamicamente com os estágios de desenvolvimento, fornecendo uma base epigenética para a regulação temporal da transcrição gênica.
• Limitações: Anticorpos de alta qualidade são necessários; alvos de baixa abundância estão sujeitos a deteções perdidas.

Priorizar o Cut & Tag nos Objetivos de Pesquisa

• Objetivos da Pesquisa: Baixo tamanho da amostra (<1×10⁴), resolução de célula única, alvos de baixa abundância (por exemplo, fatores de transcrição de baixa abundância).
• Condições de Amostra: Evitar alterações epigenéticas induzidas por entrelaçamento (por exemplo, células primárias, tecido congelado).
• Estudo de Caso:
  • Bartosovic M utilizou a tecnologia scCUT&Tag em dezenas de milhares de células do sistema nervoso central de ratos para detetar modificações de histonas ativas (H3K4me3, H3K27ac, H3K36me3) e inativas (H3K27me3), bem como a ocupação a nível de célula única de fatores de transcrição (OLIG2, RAD21); alcançando uma análise de alto rendimento das modificações de cromatina do cérebro de ratos e da ligação de fatores de transcrição.
  • A eficiência da reprogramação de iPSCs é baixa. A superexpressão de macroH2A1.1 é conhecida por melhorar a eficiência de reprogramação, mas o mecanismo de ação de macroH2A1.2 não está claro. Liorni N et al. utilizaram células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) como modelo. No dia 4 da reprogramação (pico da superexpressão de macroH2A), analisaram a ocupação do genoma, os efeitos transcricionais e as redes regulatórias usando CUT&Tag (dirigido a macroH2A1.1/1.2 rotuladas com 6-His) combinado com RNA-Seq. As suas descobertas revelaram que macroH2A1.1 promove a reprogramação através de vias neurais e regulação indireta, enquanto macroH2A1.2 pode ter um efeito inibitório, fornecendo evidências cruciais para otimizar estratégias de geração de iPSCs.
  • Limitações: É necessária a otimização das atividades de anticorpos e transposase.

Considerações Gerais

• Design de Grupo de Controlo: O ChIP-seq requer um controlo de Input (e opcionalmente IgG); CUT&Tag requer um controlo de IgG; o ATAC-seq normalmente não requer um controlo de entrada tradicional.
• Controlo de Qualidade de Dados: Para os dados de ATAC-seq e CUT&Tag, o controlo de qualidade deve abordar a contaminação por DNA mitocondrial (<10%). No entanto, utilizam métricas distintas: o ATAC-seq utiliza o escore de enriquecimento do TSS (>5) para avaliar a eficiência da captura de cromatina aberta, enquanto que para o CUT&Tag, o escore FRiP (>5%) e a razão sinal-ruído servem como métricas para a especificidade de enriquecimento das interações proteína-DNA.

Desafios Técnicos e Soluções

1. ATAC-seq

• Desafio:
  • A interferência dos nucleossomas leva a um viés no tamanho dos fragmentos.
  • Alta complexidade na integração de dados de célula única.
• Solução: Combinando ATAC-seq e RNA-seq para análise de associação multi-ômica.

2. ChIP-seq

• Desafio:
  • Os efeitos de lote de anticorpos afetam a reprodutibilidade dos resultados.
  • Um baixo rácio sinal-ruído leva a picos de falsos positivos.
• Solução: Utilizando controlos de IgG e experiências de dupla réplica.

3. Cortar e Marcar

• Desafio:
  • Flutuações na atividade da transposase Tn5 afetam a eficiência de clivagem.
  • Incapacidade de quantificar diretamente a força de ligação das proteínas.
• Solução: Otimização das condições de permeação e do tempo de reação.

Resumo e Recomendações

• Investigação Básica: Para investigação focada na acessibilidade da cromatina, o ATAC-seq é a escolha preferida; para verificar interações específicas de proteínas, o ChIP-seq é mais fiável.
• Amostras Clínicas ou Células Raras: Cut & Tag oferece vantagens significativas devido aos seus baixos requisitos de amostra e fluxo de trabalho rápido.
• Integração Multi-ômica: Para construir uma rede regulatória abrangente que vá desde o 'estado da cromatina' até a 'regulação transcricional' e, por fim, ao 'resultado funcional', recomenda-se empregar ATAC-seq (acessibilidade da cromatina), CUT&Tag/ChIP-seq (interações proteína-DNA) e RNA-seq (transcriptómica). Esta abordagem pode ser ainda mais ampliada através da integração de dados de proteómica ou fosfoproteómica para análise de correlação entre camadas.

Ao selecionar tecnologias de forma apropriada, os investigadores podem revelar de forma mais eficiente os mecanismos regulatórios epigenéticos, impulsionando avanços na biologia do desenvolvimento, medicina oncológica e outros campos.

As pessoas também perguntam

Qual é a diferença entre Cut&tag e ATAC-seq?

ATAC-Seq permite que os investigadores detetem as localizações de cromatina aberta, nucleossomas e fatores de transcrição ocupados utilizando Tn5 carregado com adaptadores. CUT&Tag revela interacções proteína-cromatina utilizando um anticorpo-alvo e pA-Tn5 carregado com adaptadores.

Qual é a diferença entre clip seq e ChIP-seq?

CLIP-seq e ChIP-seq são ambas técnicas de imunoprecipitação, mas diferem no tipo de molécula que está a ser estudada. O CLIP-seq é utilizado para identificar moléculas de RNA ligadas a proteínas ligadoras de RNA (RBPs), enquanto o ChIP-seq é utilizado para identificar sequências de DNA ligadas a proteínas ligadoras de DNA.

Qual é a diferença entre ChIP e ChIP-seq?

ChIP é um método bioquímico para isolar DNA ligado a uma proteína específica, enquanto o ChIP-seq combina isso com sequenciação de alto rendimento analisar o DNA isolado em uma escala genómica.

É melhor cut and run do que ChIP-seq?

CUT&RUN é geralmente melhor para amostras de baixo input e produz menos ruído de fundo, enquanto o ChIP-seq continua a ser robusto para modificações de histonas e certos fatores de transcrição.

Qual é a diferença entre ChIP-seq e ATAC-seq?

ChIP-seq mapeia interacções proteína-DNA em todo o genoma, enquanto o ATAC-seq detecta regiões de cromatina aberta.

Quais são as vantagens do Atac-Seq?

Comparado a estes métodos, o ATAC-Seq utiliza um protocolo mais simples, requer uma menor quantidade de amostra (cerca de metade das células), tem alta sensibilidade e é, portanto, uma abordagem potencialmente mais rápida e económica.

Qual é a diferença entre Cut&Run e ATAC-seq?

A ATAC-seq fornece uma visão genómica ampla das regiões de cromatina aberta, indicativas de potenciais interruptores de genes ativos e locais de ligação de fatores de transcrição, enquanto a CUT&RUN, CUT&Tag e ChIP-seq utilizam anticorpos específicos para proteínas de ligação à cromatina.

Quais são as limitações do cut and tag?

A principal limitação do CUT&Tag-seq é a probabilidade de sobre-digestão do DNA devido ao tempo inadequado da reação Tn5 dependente de magnésio. Uma limitação semelhante existe para os protocolos contemporâneos de ChIP-Seq, onde a fragmentação do DNA enzimática ou sonificada deve ser otimizada.

Referências:

1. Grandi FC, Modi H, Kampman L, Corces MR. Perfilagem da acessibilidade da cromatina por ATAC-seq. Nat Protoc. Jun 2022;17(6):1518-1552.
2. Nakato R, Sakata T. Métodos para análise de ChIP-seq: Um fluxo de trabalho prático e aplicações avançadas. Métodos. Mar 2021;187:44-53.
3. Fu Z, Jiang S, Sun Y, Zheng S, Zong L, Li P. Cut&tag: uma poderosa ferramenta epigenética para perfilagem de cromatina. Epigenética. Dez 2024;19(1):2293411.
4. Jiang S, Huang Z, Li Y, Yu C, Yu H, Ke Y, Jiang L, Liu J. Atlas de acessibilidade de cromatina e transcriptoma de células únicas de embriões de rato. Cell Rep. 2023 Mar 28;42(3):112210.
5. Muto Y, Wilson PC, Ledru N, Wu H, Dimke H, Waikar SS, Humphreys BD. A perfis de transcrição de células únicas e acessibilidade da cromatina redefinem a heterogeneidade celular no rim humano adulto. Nat Commun. 2021 Abr 13;12(1):2190.
6. Vonk PJ, Ohm RA. H3K4me2 ChIP-Seq revela a paisagem epigenética durante a formação de cogumelos e novos reguladores do desenvolvimento de Schizophyllum commune.. Relatórios Científicos. 2021 Abr 14;11(1):8178.
7. Mazina MY, Kovalenko EV, Evdokimova AA, Erokhin M, Chetverina D, Vorobyeva NE. A "Paragem" da RNA Polimerase II Prepara Promotores para a Transcrição Futura durante o Desenvolvimento de Drosófilas. Int J Mol Sci. 2022, 13 de setembro; 23(18):10662.
8. Bartosovic M, Kabbe M, Castelo-Branco G. Perfis de CUT&Tag de células únicas para modificações de histonas e fatores de transcrição em tecidos complexos. Nat Biotechnol. Jul 2021;39(7):825-835.
9. Liorni N, Napoli A, Castellana S, Giallongo S, Řeháková D, Re OL, Koutná I, Mazza T, Vinciguerra M. Análise integrativa CUT&Tag-RNA-Seq da orquestração dependente da variante de histona macroH2A1 na reprogramação de células-tronco pluripotentes induzidas humanas. Epigenómica. 2023 Set;15(17):863-877.