Protocolo de Sequenciação de RNA Direto por Nanoporos

Reacção de Adição de Poli(A)

1. 17 μl de RNA no tubo de PCR é incubado a 65 °C durante 2 minutos e imediatamente colocado em gelo para evitar a formação de estruturas secundárias.
Adicione 3,5 μl de Tampão de Reação 10× de Polimerase Poly(A) de E. coli a 17 μl de RNA no tubo de PCR e leve à temperatura ambiente.
3. Adicione 4,5 μl de ATP no tubo de PCR, seguido por 4 μl de polimerase poli(A) de E. coli e 1 μl de inibidor de RNase no tubo de PCR.
4. Misture suavemente com uma pipeta P200 e incube a reação a 37 °C durante 10 min.
5. Pare a reação e prossiga diretamente para a etapa de limpeza das esferas. Misture bem as esferas Agencourt RNAClean XP para que o reagente apareça homogéneo e consistente em cor. Adicione 60 μl de esferas Agencourt RNAClean XP homogéneas no tubo de PCR e misture bem usando uma pipeta P200. Incube por 5 minutos.
6. Coloque o tubo de PCR no suporte magnético durante 2 minutos.
7. Remova suavemente o sobrenadante.
8. Lave o RNA duas vezes com 80% de etanol, adicionando 180 μl de etanol a 80% e incubando por 1 minuto. Em seguida, remova o etanol sem perturbar o pellet.
Deixe secar ao ar à temperatura ambiente durante 2 minutos (até estar seco, mas não rachar).
10. Elua com 12 μl de água livre de nucleases e agite o tubo. Incube durante 2 minutos à temperatura ambiente.
Coloque o tubo de PCR no suporte magnético durante 2 minutos.
12. Pipete 11 μl de RNA com cauda poli(A) para um novo tubo de PCR e coloque o tubo no gelo.
13. Meça a concentração final de RNA (opcional).

dRNA-seq

1. Ligação do adaptador: Misture 3,0 μl do Buffer de Reação de Ligação Rápida NEBNext com RNA com cauda poli(A), seguido de 1,0 μl do Adaptador RT (RTA) e 1,5 μl de Ligase de DNA T4. Misture por pipetagem e centrifugue. Incube a reação por 10 minutos à temperatura ambiente.
2. Transcrição reversa: Prepare a mistura mestre de transcrição reversa misturando 9,0 μl de água livre de nucleases, 2,0 μl de dNTPs a 10 mM, 8,0 μl de tampão de primeira fita 5x, 4,0 μl de DTT a 0,1 M. Adicione a mistura mestre ao tubo de PCR contendo o RNA ligado ao adaptador RT. Misture com uma pipeta de 200 μl. Adicione 2 μl de transcriptase reversa SuperScript IV à reação. Coloque o tubo em um termociclador e incube a 50 °C por 10 min, depois a 70 °C por 10 min, e leve a reação a 4 °C.
3. Limpeza de RNA utilizando etanol a 80%: Vortexe as esferas Agencourt RNAClean XP para ressuspender. Adicione 72 μl das esferas Agencourt RNAClean XP ressuspensas à reação de transcrição reversa e misture por pipetagem. Incube durante 5 min à temperatura ambiente. Centrifugue a amostra e forme o pellet numa base magnética durante 3 min. Mantenha o tubo no íman e retire o sobrenadante com uma pipeta. Lave o RNA duas vezes com 180 μl de etanol a 80%. Remova o etanol a 80% utilizando uma pipeta e descarte. Centrifugue e coloque o tubo de volta no íman. Retire qualquer etanol a 70% residual com uma pipeta. Deixe secar ao ar à temperatura ambiente durante 1 min. Remova o tubo da base magnética e ressuspenda o pellet em 20 μl de água livre de nucleases e agite o tubo. Incube durante 5 min à temperatura ambiente. Coloque o tubo de volta no íman durante 1 min e pipete 20 μl de eluato para um novo tubo de PCR de 0,2.
4. Ligação de proteína motora: Adicione 8,0 μl de Buffer de Reação de Ligação Rápida NEBNext ao RNA reversamente transcrito eluído de 20 μl. Em seguida, adicione 4,5 μl - 6,0 μl de Adaptador de RNA (RMX), seguido por 3,0 μl de água livre de nucleases e 3,0 μl de T4 DNA Ligase. Misture com uma pipeta de 200 μl. Incube a reação durante 10 minutos à temperatura ambiente.
5. Limpeza de RNA usando o Buffer de Lavagem (WSB): Vortexe as esferas Agencourt RNAClean XP para ressuspender. Adicione 40 μl das esferas Agencourt RNAClean XP ressuspensas ao tubo de reação e misture por pipetagem. Incube por 5 minutos à temperatura ambiente. Centrifugue a amostra e forme o pellet numa base magnética por 3 minutos. Mantenha o tubo no ímã e retire o sobrenadante com uma pipeta. Adicione 150 μl do WSB às esferas. Feche a tampa do tubo e agite suavemente o tubo. Centrifugue e coloque o tubo de volta no ímã. Remova o WSB usando uma pipeta e descarte. Repita a adição e remoção do WSB novamente. Retire qualquer WSB residual com a pipeta. Remova o tubo da base magnética e ressuspenda o pellet em 20 μl de Buffer de Eluição e agite suavemente o tubo. Incube por 10 minutos à temperatura ambiente. Coloque o tubo de volta no ímã por 2 minutos ou até que o eluído esteja claro. Pipete 20 μl do eluído para um novo tubo de PCR de 0.2. Adicione 17.5 μl de água livre de nucleases à biblioteca de RNA preparada e misture com uma pipeta de 200 μl. O volume total é 37.5 μl.
6. Preparação e carregamento da célula de fluxo SpotON: Misture o Buffer de Corrida de RNA (RRB), o Buffer de Lavagem (FB) e os tubos de Ligação de Lavagem (FLT) cuidadosamente, agitando e centrifugando, e mantenha todas as soluções à temperatura ambiente. Para preparar a mistura de priming da célula de fluxo, adicione 30 μl de FLT diretamente ao tubo de FB e agite. Deslize a tampa do porta de priming no sentido horário para abrir o porta de priming. Ajuste uma pipeta P1000 para 200 μl e insira a ponta no porta de priming. Gire a roda até ver um pequeno volume (20 μl de cor amarela) de buffer entrando na ponta da pipeta. Carregue 800 μl da mistura de priming na célula de fluxo através do porta de priming, evitando a introdução de bolhas de ar. Aguarde 5 minutos. Durante este tempo, prepare a biblioteca para carregamento.
(a) Numa nova tubo de PCR, misture 37,5 μl de RRB e 37,5 μl da biblioteca de RNA em água livre de nucleases. Abra suavemente a tampa do portão SpotON. Carregue 200 μl da mistura de priming no portão de priming (não no portão de amostra SpotON). Ajuste a pipeta de 200 μl para 75 μl. Misture a biblioteca preparada pipetando para cima e para baixo antes de carregar no portão de amostra. Carregue todos os 75 μl da amostra no portão de amostra SpotON gota a gota. Feche o portão SpotON, feche o portão de priming e feche a tampa do MinION Mk1B.
7. Sequenciação: Dê um duplo clique no ícone MinKNOW localizado na área de trabalho para abrir a interface gráfica do MinKNOW. Clique no botão "Novo Experimento" e preencha as informações com base no seu experimento, como ID/nome da amostra. Escolha o kit RNA002. Clique em "Iniciar execução." No caso da opção de chamada de base em tempo real, certifique-se de que o computador tem recursos suficientes para executar um MinION sem deterioração do desempenho.

Referência:

1. Wongsurawat T, Jenjaroenpun P, Nookaew I. Sequenciação Direta de RNA e Identificação de Modificações de RNA Usando Nanopore[M]//Genómica Funcional de Leveduras: Métodos e Protocolos. Nova Iorque, NY: Springer US, 2022: 71-77.