Protocolo de Sequenciação Metatranscriptómica

Extração de RNA

Extração de RNA do Solo ou Sedimento

Adiciona-se 0,5 g (peso húmido) de solo a um tubo de microcentrífuga de 2 ml.
Adicionam-se 0,5 ml de brometo de hexadeciltrimetilamónio (CTAB) e 0,5 ml de fenol–clorofórmio–álcool isoamílico (25:24:1) (pH 8,0) a cada extração.
Agite os tubos num sistema de batimento de esferas durante 30 s a 5,5 m/s.
4. A fase aquosa é separada por centrifugação (16.000 × g) durante 5 minutos a 4°C.
5. A fase aquosa foi adicionada a um volume igual de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1).
A amostra é centrifugada a (16.000 × g) durante 5 minutos a 4°C.
7. O DNA e o RNA são precipitados da camada aquosa com 2 volumes de 30% (p/v) de polietileno glicol 6000–1,6 M de NaCl durante 2 horas à temperatura ambiente, seguidos de centrifugação a 18000 × g, 4°C durante 10 minutos.
8. O pellet de ácido nucleico é então lavado com etanol a 70% (vol/vol) frio, por centrifugação a 10.000 × g durante 20 minutos.
9. O ácido nucleico é então seco ao ar durante 15 minutos antes de ser ressuspendido em 1000 ml de tampão Tris–EDTA livre de RNase.
10. 100 ml do RNA total deve ser purificado com b-mercaptoetanol adicionado ao tampão RLT.
A concentração aproximada de RNA é determinada por espectrofotometria e verificada quanto à integridade do rRNA. A integridade do rRNA foi demonstrada por picos de rRNA altamente definidos e discretos, com o pico de rRNA 23S sendo 1,5 a 2 vezes mais alto do que o pico de rRNA 16S.
12. A contaminação por DNA foi removida das amostras de RNA total através do tratamento com a enzima Turbo DNA-free.

Extração de RNA da Água do Mar

Filtrar 10–15 L de água do mar através de um filtro GF/A de 140 mm de diâmetro e 1,6 mm, para reduzir a abundância de células eucarióticas e maximizar a proporção de células procarióticas.
2. Aplique o filtrado diretamente a um filtro Sterivex de 0,22 mm.
3. Após a filtração, cada Sterivex foi bombeado até ficar seco e congelado em azoto líquido.
4. Após descongelar no gelo, adicione 1,6 ml de tampão de lise SET diretamente em cima do Sterivex usando uma seringa de 2,5 ml.
Adicione 180 ml de lisozima fresca e feche o Sterivex.
6. Incubar a 37°C durante 30 min.
Adicione 200 ml de SDS.
Adicione 55 ml de proteína K fresca a 20 mg/ml.
Incubar a 55°C durante 2 h.
10. Retire o lisado para uma seringa de 5 ml.
Adicione 1 ml de tampão SET fresco ao Sterivex e gire para enxaguar.
12. Retire o tampão de lavagem para a mesma seringa de 5 ml.
13. Adicione o lisado a um tubo de 15 ml contendo 2 ml de fenol–clorofórmio–álcool isoamílico (25:24:1), pH 8. Agite suavemente até misturar e, em seguida, centrifugue a 1.500 × g durante 5 min.
14. Adicione 2 ml adicionais de fenol–cloroformo–álcool isoamílico (25:24:1). Agite suavemente até misturar e centrifugue a 1500 × g durante 5 minutos.
Adicione 2 ml de cloroformo–álcool isoamílico (24:1). Agite suavemente até misturar e centrifugue a 1500 × g durante 5 minutos.
16. Decante a fase aquosa para um tubo de centrífuga estéril de 20 ml tratado com DEPC (se RNA for necessário) e adicione 0,5 V de acetato de amónio a 7,5 M. Misture brevemente e depois adicione 2,5 V de etanol puro.
17. Misture e deixe a −20°C durante mais de 1 hora (durante a noite está bem).
18. Centrifugar a 10.000 × g durante 30 min a 4°C e decantar o etanol.
19. Adicione 2 ml de etanol a 80% e enxague o tubo, depois centrifugue a 10.000 × g durante 20 min a 4°C e decante o etanol, repetindo o processo.
20. Decante o etanol e deixe invertido durante 15 minutos na capela.
21. Suspenda o pellet em 200 ml de água estéril tratada com DEPC. Deixe em gelo durante aproximadamente 1 hora, com toques frequentes com os dedos para lavar as paredes do tubo.

Técnicas de Enriquecimento de mRNA

1. O RNA total foi aplicado ao método de hibridização subtrativa para remover o rRNA do mRNA. As instruções do fabricante fornecem detalhes suficientes para realizar este procedimento.
2. O mRNA foi eluído em 25 ml de tampão TE.
3. Remova pequenos RNAs e pequenos contaminantes, conforme as instruções do fabricante. O mRNA purificado foi eluído em 10 ml de água tratada com DEPC.
4. O mRNA foi então transcrito reversamente para cDNA utilizando uma enzima com primers aleatórios, seguindo as instruções do fabricante para a transcrição com primers aleatórios.
5. O cDNA foi tratado com RNase para remover vestígios de contaminantes de RNA, incubando-se a 37°C durante 20 min.
6. 1 ml de cDNA foi então amplificado aleatoriamente. Idealmente, esta reação é realizada 10 vezes, e depois estes replicados são agrupados para remover o potencial viés de amplificação aleatória inerente à tecnologia de amplificação por deslocamento múltiplo.
7. As amostras amplificadas são tratadas com a nuclease S1 a 2 m/mg de cDNA. A reação é incubada no tampão fornecido a 37°C durante 30 minutos. A reação é interrompida adicionando EDTA a uma concentração final de 20 mM e, em seguida, é purificada.
8. O cDNA foi nebulizado e depois limpo com esferas AMPure.
9. O cDNA foi então sequenciado.

Referência:

1. Gilbert J A, Laverock B, Temperton B, et al. Metagenómica[M]//Sequenciação de Próxima Geração de Alto Débito. Humana Press, Totowa, NJ, 2011: 173-183.