Protocolo de Sequenciação MeDIP

Fragmentação de DNA

1. Extrair DNA genómico de acordo com as células ou tecidos estudados.
2. Sonique o DNA genómico purificado.
3. Dilua 6 μg de DNA genómico em 130 μl (volume final) de tampão TE 1× e transfira para o tubo Covaris apropriado.
4. Defina o Covaris para o programa de tamanho de fragmento de 300 bp.
5. Execute o programa para cada tubo.
6. Execute 5 ou 10 μl (cerca de 400–500 ng) de DNA genómico fragmentado e 10 μl de escada de DNA em gel de agarose a 1,5% para verificar o tamanho dos fragmentos. DNA não sonicado (100–200 ng) pode ser corrido no mesmo gel como comparação.

Adição de Anticorpos

1. Meça o volume de DNA sonicado após a corrida em gel e dilua-o com 1× Tampão TE até 400 μl.
2. Desnaturar por calor em bloco de aquecimento a seco durante 10 min a 95 °C e arrefecer imediatamente em gelo durante 10 min.
3. Enquanto mantém a amostra fria, adicione 100 μl de 5× IP frio e 4–5 μg de anticorpo (anticorpo monoclonal de rato anti 5-metil-citosina) ao DNA desnaturado sonicado. Incube a mistura de DNA-anticorpo durante a noite num rotador a 4 °C.

Ligar Pérolas à Mistura de DNA-Anticorpo

1. Pré-lavar as esferas magnéticas (Usamos Dynabeads M-280 anti-IgG de ovelha para rato) da seguinte forma: Re-suspenda bem as esferas pipetando para cima e para baixo ou rodando. Elas precisam estar em uma solução homogénea e, se estiver a processar múltiplas amostras, devem ser re-suspendidas frequentemente, uma vez que se depositam rapidamente.
2. Transferir o volume total necessário (50 μl por amostra) para um tubo de centrífuga, adicionar o mesmo volume de Tampão de Lavagem (pelo menos 1 ml) e ressuspender.
3. Coloque o tubo num suporte magnético durante 1–2 minutos e descarte o sobrenadante.
4. Resuspenda as esferas em 1 ml de Tampão de Lavagem e incube durante 1 min no gelo. Coloque o tubo no íman durante 1–2 min e descarte o sobrenadante.
5. Remova o tubo do suporte magnético e resuspenda as esferas lavadas no mesmo volume de 1× Buffer de IP que o volume inicial das esferas.
6. Adicione 50 μl de esferas à mistura de DNA-antibody de 500 μl do passo 2.
7. Incubar durante 2 h numa plataforma rotativa a 4 °C.

Lavagem da Mistura de DNA-Anticorpo-Bolas

1. Após a incubação de 2 h, lave as esferas três vezes com 1× Buffer de IP da seguinte forma: Coloque o tubo no suporte magnético durante 1–2 min e descarte o sobrenadante. Remova o tubo do suporte magnético. Adicione 1 ml de 1× Buffer de IP frio. Misture invertendo o tubo ou agitando suavemente. Incube o tubo durante 1 min no gelo. Coloque o tubo no suporte magnético durante 1–2 min e descarte o sobrenadante. Repita duas vezes para um total de três lavagens.
2. Ressuspenda as esferas em 250 μl de Tampão de Digestão.
Adicione 3,5 μl de Proteinase K (20 mg/ml) às esferas ressuspendidas.
4. Incubar durante 2–3 h numa plataforma rotativa a 55 °C.

Purificação de DNA

1. Remova o parafilm e adicione 250 μl de fenol–clorofórmio–álcool isoamílico a cada tubo. Vortexe durante 30 s e centrifugue a 14.000 × g durante 5 min à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante aquoso e transfira-o para um novo tubo de microcentrífuga.
2. Adicione 250 μl de cloroformo ao sobrenadante do passo 1. Vortexe brevemente e centrifugue a 14.000 × g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante aquoso e transfira-o para um tubo de microcentrífuga limpo.
3. Adicione 2 μl do coprecipitado GlycoBlue (20 mg/ml, Life Technologies) e misture bem.
4. Adicione 20 μl de NaCl 5 M e depois 500 μl de etanol a 100%. Misture bem.
Precipitar em congelador a −20 °C durante 1 hora a overnight.
6. Centrifugar a 14.000 × g durante 20 min a 4 °C. Remover cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet azul.
7. Lave uma a duas vezes com 1 ml de etanol a 70% incubando a −20 °C durante 10 min e depois centrifugue novamente durante 10 min. Descarte o sobrenadante. Em seguida, centrifugue novamente brevemente para recolher o líquido residual no fundo do tubo e remova todo o líquido com uma ponta de pipeta fina ou de carregamento de gel.
8. Deixe as amostras secar ao ar na bancada.
Resuspenda em 25 μl de água livre de nucleases.
10. Meça a concentração de DNA.

Bibliotecas para Sequenciação de Nova Geração

1. Uma vez que os fragmentos de ADN obtidos através do MeDIP são de cadeia simples, o primeiro passo precisa produzir ADN de cadeia dupla para a preparação da biblioteca.
2. Utilize entre 10 e 1000 ng de fragmentos de DNA de cadeia simples e anexe 10 ng/μl de primers hexâmeros aleatórios à amostra aquecendo-a num ciclista térmico a 95 °C, e depois arrefecendo imediatamente em gelo.
3. Realizar a síntese da segunda cadeia de ADN, que, se estiver a utilizar o kit da NEB conforme mencionado acima, seria o passo 1.4.
4. Siga o restante do protocolo do fabricante para receber bibliotecas para sequenciação de próxima geração.
5. Determine o rendimento da biblioteca com a ajuda do Qubit High Sensitivity dsDNA Kit, e depois realize o controlo de qualidade para a faixa de tamanho dos fragmentos e concentração/molaridade.
6. As bibliotecas são sequenciadas nos sequenciadores disponíveis para si, por exemplo, Illumina HiSeq.

Referência:

1. Ben Maamar M, Sadler-Riggleman I, Beck D, et al. Mapeamento genómico da metilação de DNA 5mC por imunoprecipitação de DNA metilado (MeDIP)-sequenciamento[J]. Modificações de DNA: Métodos e Protocolos, 2021: 301-310.