Preparação da Biblioteca de Sequenciamento a partir de DNA Degradado - Protocolo

Fragmentos de DNA com Extremidades Planas

1. Prepare a mistura mestre para reparo de extremidades planas. Inclua por reação:
(a) 5.0 μL de 5× Buffer de Reparação de Extremidades.
(b) 0.25 μL de Enzima de Terminação Plana.
2. Distribua 5.25 μL da mistura em cada tubo de PCR rotulado.
3. Adicione 19.5 μL da extração de DNA em cada tubo de PCR individual (ou ajuste o volume final para 25 μL adicionando ddH₂O, de acordo com o volume inicial do template).
4. Incube a mistura em um termociclador por 20 min a 20 °C, e depois inative a enzima aquecendo por 20 min a 72 °C.

Ligação de Adaptadores

1. Remova o tubo com DNA de extremidades planas do termociclador e mantenha-o em gelo.
2. Prepare a mistura de reação de ligação de adaptadores, incluindo por reação:
(a) 2.5 μL de 10× Buffer de Ligase.
(b) 1.0 μL de adaptador P1.
(c) 0.5 μL de Mistura de dNTPs.
(d) 0.5 μL de Ligase de DNA.
(e) 2.0 μL de Polimerase de Reparação de Quebras.
3. Distribua 6.5 μL da mistura em um novo tubo de PCR.
4. Adicione 1.0 μL de cada um dos códigos de barras PGM escolhidos no tubo de PCR de cada amostra respetiva.
5. Adicione 20.5 μL de DNA de extremidades planas.
6. Incube a mistura em um termociclador por 15 min a 25 °C, seguido de 5 min a 72 °C.

Purificação por Esferas

1. Prepare uma solução fresca de Etanol a 70%, com um volume final de pelo menos 500 μL × número de amostras.
2. Adicione 40 μL de esferas SPRIselect ao produto da Subsecção 3.3, para uma razão final de 1.8× (o que deve resultar numa ampla gama de tamanhos de fragmentos recuperados e um limite superior de aproximadamente 200 bp).
3. Misture bem por pipetagem e deixe os tubos incubar por 1 min no suporte magnético.
4. Remova o sobrenadante sem perturbar as esferas magnéticas.
5. Adicione 500 μL de etanol a 70% recém preparado a cada amostra, misture bem e deixe os tubos incubar até que todas as esferas sejam capturadas pelo suporte magnético.
6. Remova o sobrenadante sem perturbar as esferas magnéticas e deixe-as secar ao ar, por um máximo de 5 min.
7. Adicione 20 μL de ddH₂O para eluir o DNA, misture bem e deixe os tubos descansar por mais um minuto no suporte magnético.
8. Remova a eluído e transfira-a para um novo tubo (rotulado), mantendo em gelo até à próxima reação.

Amplificação

1. Dilua os primers adicionando 10 μL da solução estoque de primers (a 100 μM) em 90 μL de ddH₂O.
2. Distribua 15 μL em cada tubo de PCR e adicione 5.0 μL do produto purificado.
3. No laboratório moderno de DNA, configure e execute o termociclador com o seguinte protocolo: desnaturação por 10 min a 94 °C, seguida de 15 ciclos de 30 s a 94 °C, 45 s a 60 °C e 45 s a 72 °C. A extensão final ocorre a 72 °C por 5 min.
4. Junte todas as amplificações paralelas para a mesma amostra, eluindo as bibliotecas de sequenciamento em 20 μL.
5. Visualize a concentração da biblioteca e a distribuição do tamanho dos fragmentos.

Referência:

1. Martins R F, Kampmann M L, Förster D W. Preparação de bibliotecas de sequenciamento a partir de amostras degradadas para plataformas de sequenciamento não-illumina. DNA Antigo: Métodos e Protocolos, 2019: 85-92.